高级果树育种学.doc

目录 第一讲 果树原生质体培养和融合研究进展 3 一、原生质体培养的意义 3 二、柑橘原生质体再生植株 3 （一）原生质体的制备 4 （二）原生质体分离 6 （三）原生质体的培养 7 三、柑桔原生质体的融合 8 四、枇杷原生质培养 12 五、苹果原生质培养 13 第二讲 RFLP技术 14 一、研究现状与意义 14 二、柑橘叶片总DNA的提取方法 17 三、分子杂交（molecular hybridization） 18 四、几种柑橘在rDNA上的RFLP差异 18 第三讲 RAPD（随机扩增多态性DNA）技术 20 一、概述 20 二、PCR基本原理 21 （一）PCR反应中的主要成分 21 （二）PCR反应参数 23 三、RAPD技术在果树上的应用 25 （一）构建遗传连锁图和基因定位 25 （二）用于演化、分类和鉴定 25 （三）外源染色体的鉴定 25 （四）用于早期鉴定 26 四、RAPD技术的存在问题和展望 26 第四讲 基因转移技术 27 一、基因转移技术 27 （一）Ti质粒载体 28 （二）病毒载体法 29 （三）DNA直接转化法 29 （四）电激法（electroporation） 30 （五）基因枪法 30 二、基因转化受体的分离和筛选 30 三、基因转化受体的验证 31 四、基因工程在园艺植物育种中的应用前景 31 （一）改良品质 32 （二）提高抗病虫能力 32 （三）改善抗逆性 32 （四）提高光合作用和固氮效率 33 （五）创建雄性不百材料 33 （六）延迟成熟与保鲜 33 （七）选育抗除草剂品种 33 五、基因转移技术在果树中的应用 34 （一）抗病性 34 （二）抗虫性 34 （三）抗除草剂 35 （四）其他 35 五、转基因研究的展望 36 第五讲 离子注入生物效应及育种研究进展 38 一、引言 38 二、一般原理 38 三、实验与分析 40 （一）溅射现象 40 （二）辐照损伤 40 （三）氮的植入影响 43 （四）群体生物效应 44 五、展望 44 第六讲 AFLP及其在果树上的应用 46 （一）AFLP技术的发展及其原理： 46 （二）AFLP的技术方法及其特点 48 （三）影响AFLP实验成功的关键因素 52 （四）AFLP在果树上的应用 53 （五）AFLP存在的问题 55  第一讲 果树原生质体培养和融合研究进展 一、原生质体培养的意义 原生质体（protoplast）是指通过质壁分离去除细胞壁后，由质膜所包被的裸露细胞。1960年Cocking曾用酶法制备番茄原生质体首获成功。现已从许多植物的多种材料中制备出大量有活力的原生质体。原生质体研究对柑橘某些生理遗传理论问题和育种应用都具有重要意义，主要有如下几方面： （1）作为转基因受体再生植株 Vardi等（1990）利用PEG法将外源nptⅡ基因导入柠檬原生质体并再生成转基因植株，开创了在木本植物中应用的先例。 （2）突变体筛选 邓占鳌（1989）曾以甜橙胚性愈伤组织为材料，经-γ射线和EMS处理，获得能耐0.8%NaCl耐性系，但耐盐性尚不能稳定地保持。 （3）原生质体融合 通过异源原生质体融合，可以吸收外源遗传物质，实现体细胞杂交（somatic hybridization）、体——配融合，产生遗传上修饰的细胞，扩大了远缘杂交的范围，开辟了育种的新途径，对遗传工程研究也起到重要的作用。 （4）种质资源的保存 柑橘种质资源可将其胚性愈伤组织，在超低温条件下冷冻贮存，能保持其活力，因此能在很小范围内保存大量种质。 （5）生物学基础方面的研究 关系到如细胞壁的生物合成、细胞膜的结构与功能、细胞器特性、细胞分裂、核质关系、抗性机制以及遗传学和分子生物学等许多方面。 二、柑橘原生质体再生植株 柑橘原生质体培养研究始于70年代，Vardi等（1972）用沙莫蒂甜橙的幼胚珠形成的愈伤组织分离出原生质体，经培养后分裂形成细胞团，以后由再生胚状体长成再生植株。柑橘原生质体到植株再生的过程见图11-7和图版 所示。到1993年12月止，世界上柑橘类已有23个种或品种通过原生质体培养得到再生植株（表11-9）。研究进展很快，成效显著，但还存在不少问题，许多方面尚有待深入研究。 图11-7 植物原生质体的分离和发育示意图 表11-9获得的原生质体再生植株的柑橘种类品种 种类 品种 起始材料 甜橙 沙莫蒂 胚性愈伤组织 哈姆林 胚性愈伤组织 葡萄柚 邓肯葡萄 胚性愈伤组织及叶肉 柚 宽皮橘 丹西红橘 胚性愈伤组织及叶肉 默科特 胚性愈伤组织及叶肉 柠檬 粗柠檬 叶肉 兰朴来檬 叶肉 酸橙 四季橘 澳洲指檬 山金柑 胚性愈伤组织及叶肉 悬浮胚性愈伤组织 胚性愈伤组织 胚性愈伤组织 （一）原生质