第五章_cDNA文库的构建.ppt

第五章 cDNA文库的构建和筛选;以mRNA为模板反转录出的DNA称cDNA。; cDNA文库的特点;3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。 4. 不均匀性 在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。 ?5. 各cDNA均可获得表达; 建立cDNA文库的一般程序;第一节 将RNA转变成cDNA;mRNA纯化;二、cDNA合成;cDNA的第一链合成; 莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV)的反转录酶; 引物;在总的RNA中可作为具有mRNA的特异引物; 第一链合成过程;;第二链合成;用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉）。;cDNA 合成; 改进;;cDNA末端修饰;加人工接头;;三、cDNA克隆载体;λZapcDNA 载体;;λZapcDNA载体的噬菌粒营救;第二节 cDNA文库的筛选;一、简并寡核苷酸探针;;操作过程; 简并探针的假阳性; 解决方法：;;2）PCR猜测体技术 ;根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物，以cDNA为模板，进行扩增; 二、抗体探针; 抗体鉴别阳性克隆;;三、差示杂交;;;四、扣除杂交;操作：;A;;第三节 cDNA表达文库的功能筛选;二、酵母双杂交系统;基本原理：;例：; 组成元件;;酵母双杂交文库筛选策略;; 优点：; 缺点：;三、cDNA噬菌体展示; 实验策略; 筛选方法;; 常用的免疫抗体; 优点;第四节 用克隆cDNA作为反应物;二、RNase 保护实验; 反义RNA探针的制备;反转录酶;; 优点：;;