第三章 基因克隆载体复习.ppt

主讲教师:任国领; 基因克隆载体概述;必备条件;3.1 质粒克隆载体;构型：;3、复制特点;（２）迁移作用： 不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～;６、显性质粒和隐蔽质粒;Col质粒（产大肠杆菌素） Ｆ质粒（引起细胞结合的育性质粒） 降解毒物的降解质粒 Ｔi质粒 隐蔽质粒 蓝藻内源质粒 ;１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） 复制子由复制起点、复制区、复制终点组成。 是能够进行独立复制的一种遗传因子。 每一个复制子都含有一个特定的RNA聚合酶结合的序列和DNA复制起始部位，即开始复制的复制区。;;3.1 质粒克隆载体;４、分子尽可能小（转化率高）， ＞15kb转化率↓↓;1、pBR322构建 目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点。 质粒载体命名法则 “pBR322” p：质粒（plasmid ) BR：两位主要构建者 322：实验编号; ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。 衍生的pMB1为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好的选择标记基因和克隆位点）。 pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型，含有Tcr 基因。;;; ;（3）两种抗菌素抗性基因;;;3.1 质粒克隆载体;pUC包括四个组成部分：;; 含乳糖操纵子的启动子、调节因子和 β-半乳糖苷酶的N端146残基(α-肽) 合成有活性的 基因（lac Z`）的质粒载体引入可编 β-半乳糖苷酶 码C端部分残基的宿主(与Lac Z`互补 的大肠杆菌) 在含IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖） 蓝色菌落 的诱导培养基上培养 在N端α-肽的编码区插入MCS 不影响lac Z`基因功能 插入外源DNA 灭活lac Z`基因 白色菌落;;pUC质粒载体的优点;测序方便;TA克隆载体——针对PCR产物的克隆 原理 PCR产物在Taq酶的非模板依赖活性作用下，于3`端加一非配对的A。 故可研制一种线性载体，其5`端各带一不配对T，可直接与PCR产物以TA连接进行克隆，即TA克隆。;TA载体的再生方法 （1）克隆载体线性化 （2）克隆载体末端补平反应 （3）克隆载体末端加T反应 注：再生后的TA载体，原线性化的酶切位点消失;知识回顾;3.2 病毒（噬菌体）克隆载体;生活周期 ;溶源周期 ;一、λ噬菌体克隆载体;2、λ噬菌体基因组有基因61个以上 ;3、 限制性核酸内切酶位点: 56种 4、 λ噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶源生长途径 5、λDNA 的复制模型 ?复制 滚环式复制 ;进入溶原状态时，只有少量基因表达，包括编码阻遏物的cI基因（抑制裂解基因的表达），正向调控自身基因的表达；int基因的表达（整合到基因组）。; 研究E.coliDNA复制时，采用3H标记的T ，经放射自显影和电子显微镜拍照，展示了“θ”形结构而得名。;滚环复制过程; DNA聚合酶以（-）链环为模板，从（+）链的3’-OH端共价延伸，合成子代（+）链DNA。; (4)DNA聚合酶以延伸的单链DNA为模板，合成子代双链DNA。; (5) 连接各岗崎片段，子代DNA形成线状或环状。;3.2 病毒（噬菌体）克隆载体; 1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 对大肠杆菌有很高的感染性，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞里，容易保存。在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量繁殖。 2、能承载较大的外源DNA片段 λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点;策略: 切去部分非必需区; 删掉多余的限制性内切酶位点; 插入选择性标记基因; 建立体外包装系统。 ; 2、在λDNA的非必需区内插入选择标记基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代 获Spi-表型 在P2噬菌体溶原性细胞中能生长 野生型λ噬菌体(Spi+表型) 在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长 局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 （2）最常用的筛选标记：Lac Z基因;3、建立重组λDNA分子体外包装系统 体外重组DNA分子必须经体外包装成