第七章 固定化酶与固定化细胞.ppt

第七章 固定化酶和固定化细胞;　酶的比活力（specific activity）代表酶制剂的纯度。 比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。;; 固定化酶的概念：所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。 通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。;1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象； 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开???了固定化酶应用于工业生产的先例； 1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme； 1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。 1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。;从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。;（4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中。;第二节 固定化酶的制备方法;固定化酶（细胞）的制备方法;一、吸附法;物理吸附法(physical adsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。 物理吸附法常用的载体： 有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。;离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。 离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。 此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。;离子吸附法常用的载体： 阴离子交换剂：二乙基氨基乙基( DEAE）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、 DEAE—葡聚糖凝胶等； 阳离子交换剂：有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。 其吸附容量一般大于物理吸附剂。 DEAE—纤维素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。;E.G. DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-Sephadex A25充分溶胀,用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.0-7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g湿重载体加60mL酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。 固定化酶活力回收50-60％，水解乙酰—DL—A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。 ;二、包埋法; （1）凝胶包埋法 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。 ; E.G.1 聚丙烯酰胺凝胶包埋 将1mL酶溶液溶于适当缓冲液,加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3mL溶液中，再加0.5mL 15％的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25C?,保温10min，便得含酶凝胶。 将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒,于低温储存或冷冻干燥。 为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。; （2）微胶囊包埋法 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。 它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。 常用于制造微胶