第四章-反向遗传学及其相关技术.ppt

2002年5月，Lindenbach(美),双链RNA→艾滋病病毒细胞→减少艾滋病病毒基因表达90%以上。 2002年7月,Novina等用RNAi技术实现了HIV1病毒的阻抑。 2002年7月, McCaffrey(美)等人, 双链RNA+肝炎Ｃ病毒-标志基因→鼠肝脏→抑制标志基因的表达/肝炎Ｃ病毒基因的表达。 利用RNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。 共抑制、基因压制和RNAi→dsRNA→降解靶mRNA→抑制靶基因的表达。均属于PTGS！ dsRNA导入线虫→RNAi ；dsRNA注射线虫体腔→RNAi ；dsRNA浸润线虫/dsRNA的工程菌喂养线虫→RNAi。 dsRNA导入植物→RNAi；同样，dsRNA注射植物韧皮部→RNAi；吸附500bp基因片段的金属片插入植物→侵入点组织发生RNAi。 RNAi普遍存在于各种生物中,具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达mRNA的生物学功能。 增强子陷阱( enhancer trap )：转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。 启动子陷阱(promoter trap)：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。 修饰的方法-增强子陷阱与启动子陷阱 Mu转座子系统 转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。 可以在拟删除基因两侧各插入一个mini-Mu转座子，然后在两个插入位点之间制造缺失。 这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移。 特点： 不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可 载体构建迅速，技术简单 载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。 三、基因沉默技术 反义RNA RNA干扰（RNAi） 反义RNA技术 反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类： 1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象的变化，从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA的转录。 （一）概念 RNA干扰(RNA interference，RNAi)： 与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种序列特异性转录后基因沉默现象。 RNA干扰 基因沉默 转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS) 基因沉默 转录水平的基因沉默（TGS）是指基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。 引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： 基因及其启动子甲基化：通常发生在DNA的CG序列的碱基上，该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。 同源基因间的反式失活：拥有同源序列的沉默位点和其他位点的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 后成修饰作用导致的基因沉默：指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。 转录后水平基因沉默（PTGS）则是指基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在的现象。 引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种： 共抑制：由Napoli在转CHS基因的矮牵牛花中发现，普遍存在于转基因植物中。其发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。 具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无mRNA积累，是典型的转录后水平基因沉默。共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。 基因压制