免疫实验课件.细胞毒作用.pptVIP

补体依赖的细胞毒实验 Complement-dependent cytotoxicity 本次实验目的 1 掌握细胞毒实验的原理 2 补体依赖细胞毒实验基本操作步骤 3 了解补体依赖细胞毒实验的应用 补体的作用和激活途径 补体的作用 溶菌和溶细胞 促进中和溶解病毒 调理吞噬 炎症介质 补体的激活途径 经典途径 旁路途径 MBL途径 实验原理 + 补体 台盼蓝染液 抗原与抗体结合 实验主要材料 小鼠 抗?血清（ ? ） 3. 补体：新鲜豚鼠血清（补） 4. 磷酸盐缓冲液（ PBS ） ，载玻片、盖玻片、一次性移液管 5. 台盼蓝染色液 (于讲台上取) 实验材料 需要回收的： 清洗完交至讲台处由老师检查：剪刀、镊子、筛网(200目)、玻璃培养皿、 研磨棒。 操作步骤 一、小鼠胸腺/脾脏细胞悬液的制备 4~6周龄小鼠断颈处死，取出胸腺/脾脏放至含有1~3 mL PBS的平皿中，以剪刀和镊子将组织处理成单细胞悬液。 胸腺 注意事项： 小鼠断颈要迅速、彻底，以防小鼠挣扎过程中出血过多，也可事先摘眼球放血。 脾脏 操作步骤 ? 振荡混匀，置37?C水浴箱，10min ? ? 振荡混匀，置37?C水浴箱，20min ? 分别取100ul细胞，各加100ul 0.4%台盼蓝，混匀后立即镜下观察 ? 振荡混匀，滴片加盖玻片，镜检 Ag+Ab complement 二、细胞毒实验： 按下表加样 PBS /脾脏细胞 结果观察 台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝。 如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有意义。 A B A. 对照组 B. 实验组 注意事项： 台盼蓝染色后放置时间不能太长，2-5min之内观察结果，否则出现假阳性，需要重新染色。 计算杀伤率： 在高倍镜下计数200个细胞中死细胞的百分率 操作步骤 ? 振荡混匀，置37?C水浴箱，10min ? ? 振荡混匀，置37?C水浴箱，20min ? 分别取100ul细胞，各加100ul 0.4%台盼蓝，混匀，室温2min ? 振荡混匀，滴片加盖玻片，镜检 Ag+Ab complement 二、细胞毒实验： 按下表加样 PBS PBS 补体依赖细胞毒实验的应用 检查细胞膜抗原 鉴定抗体的特异性 微量淋巴细胞毒试验 检测人体的组织相容性 选择性地去除某一细胞亚群 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *