第六章其他透射电镜样品制备技术.ppt

早在1959年，就发展了免疫铁蛋白技术。免疫铁蛋白是一种含二价铁离子(Fe2+)的蛋白质，单体分子量445000D，含铁量23％。一般常从马的脾脏中提取铁蛋白。铁蛋白的外壳直径100～120nm，内含直径55～60nm的铁胶粒核心，而胶粒内有2000～3000个铁原子。这些铁原子分布于四个区域内，各组成一个圆形的密集区，使之成为电子致密物。免疫铁蛋白技术适于研究悬浮液、细胞表面、细胞内的抗原的定性或定位，如：病毒、细菌、红血球、腹水癌细胞和淋巴细胞等抗原的定位等，还可用于病理学中研究抗体的形成及其在细胞内的定位等。但由于铁蛋白的分子量较大，更适于研究表面抗原的定性与定位。 （1）免疫铁蛋白的反应机制 1)直接法：这种方法比较简单，是把样品直接浸泡 在标记的抗体中，抗原抗体发生免疫结合反应。 在一定条件下使 2)间接法：间接法比较复杂，但有一定的优势，如： 用铁蛋白标记的羊抗兔抗体可做多种抗原的兔抗 血清实验，因此能提高工作效率。而且敏感性也 比较强，所以更常用。铁蛋白间接免疫反应的机 制如图所示。 免疫铁蛋白技术分为直接法和间接法。 铁蛋白 二抗 抗原 一抗 样品 免疫酶反应以酶作为一抗或二抗的标记物，形成一抗—酶复合物或二抗—酶复合物，然后直接或间接与抗原作用，形成水不溶性免疫复合物，再与适宜的底物作用，生成电子致密的反应产物，使能用电镜检测出样品中抗原的定性和定位信息。 （2）免疫酶的反应机制 一般选择标记酶时要注意以下几点 一是酶的纯度高，性能稳定，特异性强，又是可溶 性的； 二是易检测，敏感性强； 三是与底物作用后能形成致密物，可用电镜检测： 四是与抗体交联后仍能保持酶的活性，便于进行定 性、定位和半定量的研究。 辣根过氧化物酶，分子量4万 酸性磷酸酶，分子量15万 碱性磷酸酶，分子量10万 葡萄糖氧化酶和B-D—半乳糖苷酶 这些酶的分子量都比铁蛋白的分子量小得多，易于渗透，所以适于研究细胞内的抗原的定性和定位，其中尤以辣根过氧化物酶(HRPase)应用最广。另外碱性磷酸酶适于标记植物细胞的抗体。值得注意的是，由于人体和动植物体内的组织和细胞中含有大量的抑制性内源酶，往往会产生各种非特异性的反应，并干扰特异的反应结果。所以在制备样品和分析结果时要考虑到这些因素，并采取必要的措施，设计严格的对照实验。另外底物的选择也是很重要的，一般常用作底物的有H202和DAB-4HCl等。 目前常用来标记抗体的酶 胶体金是一种由极小的金颗粒组成的、带负电荷的、疏水性的胶状体。一般市售胶体金的金颗粒的直径由3～180nm不等，常用的是5～30nm。胶体金性能稳定、对细胞无毒性、金颗粒形状规则、电子密度高、便于观察和分析，再加上市售的胶体金的金颗粒的直径规格不同，所以能选择差别较大的2～3种，对同一细胞中的不同种抗原进行双重或三重标记，以便进行抗原的定性和定位的比较研究。因为胶体金颗粒的直径是那样的小，一方面能提高标记的准确性，另一方面容易渗透到细胞质里，甚至细胞质中的一些细胞器里。所以自1971年，Faulk和Taylor首次把胶体金作为一种标记物引入免疫电镜技术以来，得到日益广泛的应用。 （3）免疫胶体金的反应机制 免疫胶体金是胶体金与一抗(直接法)或二抗(间接法)先结合，生成免疫抗体或抗抗体复合物，再与细胞中相应的抗原发生特异性免疫反应，形成抗原与胶体金标记的抗体或抗抗体复合物。由于金颗粒的电子密度高，所以电镜下检测到的金颗粒存在的部位，即是所探求的抗原在细胞中的定位。另外通过分析金颗粒的相对密度的高低，还能进行半定量的研究。 免疫电镜样品制备的方法比较复杂，因为它既要良好地保存样品的精细结构，又要最大限度地保存被检测抗原的活性，还要尽量增加标记抗体的渗透性。而这三者之间又互相矛盾，特别是样品结构的保存和被检测抗原活性的保存之间，更是互相制约。所以设计免疫电镜样品制备的程序时，必须考虑多方面的因素，取其折衷，才能获得理想的结果。 3.免疫电镜样品的制备 一般认为，主要的问题是选择最佳的固定方法。为了在最佳地保存样品精细结构的同时，又能最大限度地保存样品中抗原的活性，设计了许多固定的方法。如：尽量避免用锇酸和高锰酸钾固定，单独用多聚甲醛固定，或用多聚甲醛-戊二醛联合固定，或在醛类固定剂中添加过碘酸、赖氨酸、苦味酸等。另一个重要的问题是选择最佳的抗体稀释度，因为稀释比例过低或过高都会直接影响免疫反应的效果，所以在摸索最佳实验条件时，要多设几组不同稀释比例的对照，以供选择。下面分别介绍未标记的抗体和标记抗体的免疫染色的基本程序。 以病毒悬液为例，主要有以下三种未标记抗体的染色方法。 1)免疫吸附法(又称免疫捕捉法)