克拉维酸钾中有关物质G的化学合成与结构鉴定.docx

ｄｏｉ１０．３９６９ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５４２５．２０１３．０１．２２克拉维酸钾中有关物质 Ｇ 的化学合成与结构鉴定陈 仿１ ，靳孝庆１ ，曹广祥１ ，张晓晓１ ，王珊珊２ ，钟传青２（１．鲁南制药集团科研部，山东 临沂 ２７６０００；２．山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 ２５０１０１）摘 要：以 Ｌ－酪氨酸和琥珀酸酐为原料、氯化锂为催化剂、冰醋酸为反应溶剂合成了药品克拉维酸钾中的有关物质Ｇ。 研究了反应溶剂的种类、反应物料配比、反应温度、反应时间等因素对有关物质 Ｇ 收率及纯度的影响，在 Ｌ－酪氨酸和 琥珀酸酐的摩尔比为１∶１．５、９５ ℃ 加热反应１．０ｈ的优化条件下，有关物质 Ｇ 粗品的最高纯度达到８７．４％ ，收率为８５．７％ 。 通过制备液相色谱对粗品进行纯化，有关物质 Ｇ 的纯度达到９９．６％ ，总收率为 ６８．６％ 。 采 用 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ 对 所 合 成物质进行了结构鉴定，确定其为欧洲药典中克拉维酸钾的有关物质 Ｇ。关键词：克拉维酸；有关物质 Ｇ；化学合成；结构鉴定中图分类号：Ｒ９７８．１１文献标识码：Ａ文章编号：１６７２－５４２５（２０１３）０１－００８４－０４克拉维酸（Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄ）是 一 种 不 可 逆 性 竞 争型β－内酰胺酶抑制剂，可与β－内酰胺酶的丝氨酸活性 位点不可 逆 结 合，从 而 保 护β－内 酰 胺 类 抗 生 素 的 活 性［１，２］。 随着细菌 耐 药 性 的 不 断 增 强，克 拉 维 酸 在 临 床上的应用越来越广泛，最成功的例子就是葛兰素公 司的 Ａｕｇｍｅｎｔｉｎ（克拉维酸钾与 阿 莫西林的复合制 剂）［３，４］。 克拉维酸钾一般采用发酵法生产，生产过程 中始终存在 Ｎ－琥珀酰酪氨酸（结构式见图１），在欧洲药典中标识为有关物质 Ｇ，并且不容易在提取过程中 去除［５］。 随着人们对药品质量的要求越来越高，有关物质 Ｇ 因为对药品质量影响很大，其含量要求也越来 越严格，因此研究有关物质 Ｇ 的性质、控制生 产 过 程 中有关物质 Ｇ 的产生、降低药品中有关物质 Ｇ 的含量 非常关键。 由于 克 拉 维 酸 钾 中 有 关 物 质 Ｇ 的 标 准 品的价格极其昂贵，严重限制了对其性质的研究。法和提高克拉维酸钾药品质量提供帮助。实验１主要试剂与仪器Ｌ－酪氨酸（生物纯）、琥珀酸酐（化学纯）、有关物质Ｇ 标 准 品 （Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅ－ＥＤＱＭ ＣＳ ３００２６Ｆ－６７０８１ＳｔｒａｓｂｏｕｒｇＣｅｄｅｘ）、氯化锂、冰醋酸、乙酸乙酯、 碳酸氢钾、无水乙醇、乙腈（色谱纯）、三氟乙酸、丁二酰 氯、四氢呋喃、硫酸。 所用试剂除注明外均为分析纯。Ｒ－１００１Ｎ 型旋转蒸发仪，循环水式真空泵，ＨＤＭ－２５０Ｂ 型电加热 套，ＤＬＳＢ 型 低 温 冷 却 循 环 泵，梅 特 勒ＡＬ１０４ 型 分 析 天 平，ＬＧＪ－１０ 型 冷 冻 干 燥 机，ＤＺＦ－６０５０Ｂ 型真空干燥箱，Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ 型液相色谱仪，北 京创新通恒制备色谱仪（５０ ｍＬ 泵，ＵＶ 检测器，５ ｍＬ 定量环），Ａｇｉｌｅｎｔ１２００－６４１０型液相质谱仪。１．１合成方法１．２酸酐法１．２．１称取 ７．８１ｇ Ｌ－酪 氨 酸 和 ６．００ｇ 琥 珀 酸 酐 放 入２５０ｍＬ三口烧瓶中，加入５０ ｍＬ 冰醋酸和 ０．２ｇ 氯化 锂，放入电热套中加热，常压下缓慢升温至９５ ℃，搅拌 回流反应１．０ｈ。将反应液减压蒸馏至无液体滴出后， 向三口烧瓶中加入５０ ｍＬ 纯水，搅拌溶解，再用５０ｍＬ 乙酸乙酯萃取水相３次，合并乙酸乙酯相。将乙酸乙酯 萃取液置于低温冷却循环泵中，－２０ ℃ 冷冻除水，过滤图１ 有关物质 Ｇ 的分子结构式ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｓｕｂｓｔａｎｃｅＧＦｉｇ．１作者分别采用酸酐法和酰氯法合成克拉维酸钾有关物质 Ｇ，并通过 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ 对所合成物质进行了结 构鉴定，以期为研究有关物质 Ｇ 的生成机制、控 制 方收稿日期：２０１２－０８－１４作者简 介：陈 仿 （１９８２－ ），女，江 苏 邳 州 人，助 理 工 程 师，研 究 方 向：生 物 制 药 工 程；通 讯 作 者：钟 传 青，博 士，副 教 授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｃｈｑ＠１６３．ｃｏｍ。８５陈仿等：克拉维酸钾中有关物质 Ｇ 的化学合成与结构鉴定／２０１３ 年第１ 期去除冰渣。向除水后的乙酸乙酯相中加入２０ｍＬ２０％碳酸氢钾溶液进行反萃，搅拌２０ ｍｉｎ 后，静置，分出重 相液，向其中加 入 １Ｌ 无 水 乙 醇，室 温 下 养 晶 １ｈ。 抽 滤，滤饼 ８０ ℃真空干燥２ｈ，得有关物质 Ｇ 粗品。溶液的配制１．４．１．２标准品溶液：精密称取克