Taqman技术不使用：“内对照系统”只能作为一种定性的测定.doc

Taqman技术不使用“内对照系统只能作为一种走定性的测定 上海皓源生物科技有限公司 黄道培 　　Taqman是一种PCR的衍生技术,由Rode Molecular System Inc.(罗氏公司)发明,并在西方发达国家注有专利。该系统一直用于研究单位,没有得到FDA的批准,在国际上不能用于临床检测。但它具有操作简便,自动化程度高,较易防止污染等特征。它对样品的测定主要使用CT值(临界循环数值),阳性样品在CT(临界循环)后信号以对数升高,而阴性样品仍保持在低水平。现将Taqman和常规PCR(Amplicor)之间的比较,列于表1。　　表1 PCR ELISA与荧光法（Taqman）比较 ? PCR ELISA Taqman 原理 PCR常规技术（Taqman） PCR衍生技术（Taqman） 特异性 好 好 灵敏度 103病毒单位/ml 以CT值表示，无内对照，不能用于定量 内对照系统 有 无 准确性 以相对值表示可分辩度相差一倍的样品 以CT值表示，无内对照，不能用于定量 循环数 32到36循环，PCR线性范围内样品稀释法可使高浓度血清PCR放大仍在线性范围内 40循环，不定期到了PCR平台区。 使用临界循环值CT来“计量”。 Taq酶作用 耐热DNA聚合酶 5’-3’外切酶活力难测定造成计量困难 引物和探针 分开，测定时互干扰 引物和探针必须“同时”形成杂交链才会有信号 仪器 临检实验室常规仪器PCR仪、酶标仪、投资少。 或全自动仪COBAS-T PE5700单波长，不能用于定量； PE 7700双波长、lightcycler(Roche)3波长、Icycler(Biorad)4波长、加入内对照系统后可用于定量。 操纵方式 样品制备简单，可保证HBV病毒不丢失检测步骤较多 检测较简便，样品制备需离心，不能确保100%的回收。 防污染 加入UNG可防103-104个扩增产物分子的污染 除扩增产物污染外，样品中蛋白质等也可能引起荧光污染，需有专用手套、反应管等，样品中不能含蛋白质。 发展方向 与未来的发展基因芯片能兼容 自成一体，受限于荧光标记物和仪器的波长，不可能与基因芯片等技术兼容 FDA批准情况 批准 未申报 临床使用情况 自93年至今（Amplicor） 未用临床临测 获SDA批准 HVBQ（定量）（浩源） TB（定性）（华美）（宏锦） HBV定性（达安、匹基） HCV定性（达安、匹基） 　　Taqman作为自动化程度很高的一种方法,具有其应用价值,但根据PCR方法的原理和临床实践。使用Taqman作定量PCR时必需具备内对照系统。这是我国专家们的一致意见。SDA也没有对缺少内对照系统的Taqman试剂发给“定量的新药证书。　　“内对照系统可校正PCR效率而获得定量结果,它是国际上公认的科学方法。当PCR的循环数为34时,常规的(或称终点法)PCR产物数量和PCR平均效率有密切的关系。　　目前国内所使用的Taqman和常规法之间的不同是前者用即时法,使用CT值来代表样品的浓度。而后者用终点法在PCR完成后测出全部的PCR产物量,再确定原样品浓度。简单地说,Taqman对PCR平均效率的敏感区,由34循环减少到了20到24循环,这时PCR平均效率的影响,要比终点法稍小一点(见表2A),即若平均效率为±10%时,从相差7倍减少到相差3倍。　　　　　　　　　　　　表2 PCR平均效率与放大倍数的关系 （1+X）n=（AF）公式 X效率 n循环次数 AF放大倍数 100% 20 1．1E+106 90% 20 3.8E+105 85% 20 2.2E+105 80% 20 1.3E+105 75% 20 7.3E+104 70% 20 4.1E+104 65% 20 2.2E+104 60% 20 1.2E+104 100% 34 1.7E+1010 90% 34 3.0E+109 85% 34 1.2E+109 80% 34 4.8E+108 75% 34 1.8E+108 70% 34 6.8E+107 65% 34 2.5E+107 60% 34 8.7E+106 100% 40 1.1E+12 90% 40 1.41E+11 85% 40 4.86E+10 80% 40 1.63E+10 75% 40 5.27E+09 70% 40 1.65E+09 65% 40 5E+08 60% 40 1.46E+08 　　　　　目前在我国常规PCR法使用34循环 　　　　　Taqman临界循环数CT≥20循环　　在不使用“内对照系统时,让我们来看一下Taqman PCR平均效率对CT的影响。　　为了更直观地了解X