实验五神经元的培养. - 实验一 哺乳动物细胞的培养、冻存和融合.ppt

实验五 神经元的培养 一、实验目的 1、学习分辨subventricular zone (SVZ)区，掌握神经元原代培养技术。 2、了解神经元的培养条件，认识神经元的形态并学会判断神经元的生长状态。 3、学习免疫荧光染色技术并拍照进行神经元的鉴定。 二、实验材料、试剂与器材 1、高糖DMEM、胎牛血清神经、基本培养基、B27、丙酮酸钠、L型谷氨酰胺、胰蛋白酶、EDTA、0.01% L-型多聚赖氨酸、二甲基亚砜、青霉素、链霉素、多聚甲醛、mouse anti-GFAP单克隆抗体、rabbit anti-NCAM单克隆抗体、FITC-β-III-Tubulin单克隆抗体、FITC标记山羊抗鼠二抗、FITC标记山羊抗兔二抗、Hoechest 33258。 2、细胞培养箱、微量移液器、倒置相差显微镜、解剖显微镜、细胞培养皿、脑膜镊、荧光显微镜、电子天平、pH计、离心机、超净工作台、电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温水槽、超声波清洗机、立式压力蒸汽灭菌器。 三、实验原理 神经元是神经组织内高度分化的细胞，数量庞大，形态多样，结构复杂，是神经组织结构和功能单位 。 本实验神经元来自于海马区域，主要利用不同细胞差速贴壁的特点进行分离培养，同时对所得到的细胞进行形态学的观察和相关的免疫抗原反应鉴定。 神经元培养传统的有血清培养和无血清培养，血清成分复杂，会对海马区神经元的体外生长造成不良影响。无血清培养基可以相对纯化神经元。同时，无血清培养液构成成分清楚，有利于实验条件的稳定，利于研究特定因素对体外培养神经元的影响。 实验步骤： 1、神经元的分离与培养 取出生1-2 d的SD新生大鼠，断头法处死，取出全脑，解剖显微镜下切取脑室下区 (Subventricular Zone, SVZ)，置于预冷的D- Hank’s溶液中，巴氏吸管机械打散后加入0.25%胰蛋白酶，37℃下消化15 min，1 ml血清终止消化后，D-Hank’s液1000转/分离心2次，H-DMEM1000转/分离心1次，用SVZ细胞培养液吹打混匀，制成单细胞悬液，记数细胞活力后，按2.5104/ml密度接种于35 mm培养皿中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中静置培养，每三天换液。 2、神经元的鉴定 将体外生长10天左右的神经元吸出培养液后，0.01 M PBS（PH7.2）洗两次，每次5 min。吸去PBS，加入4%多聚甲醛，4℃冰箱固定过夜后吸去固定液，PBS洗三次，每次5 min。滴加用PBS + NaN3（0.02%）+ BSA（3%）+ TritonX-100(0.2%)稀释的鼠抗FITC-β-III-Tubulin IgG（1：200），4℃冰箱固定过夜后PBS洗三次，每次5 min，加入1 μM Hoechst 33258室温孵育5 min，PBS洗两次，共5 min，最后50％缓冲甘油（PBS配制）封片，荧光显微镜下观察阳性细胞。阴性对照采用PBS代替抗体，结果阴性。 数据处理与统计分析： 所有的实验数据：包括一级分叉数，二级分叉数，分叉总长度等由Image J和Image pro plus计算。数据分析p0.05即认为有差异。 注意事项： 1、正确的切取SVZ区，切取的范围不要太大，脑膜、血管尽量剔除干净，以免杂细胞太多影响神经元的纯度。 2、切取SVZ区时速度要快，避免影响细胞活性。 3、所有的试剂使用前都要放在冰上预冷，以保持细胞活性。 4、培养神经元的培养瓶要提前用PLL包被好。 【思考题 】 1、SVZ区所处于什么位置？为什么要选取SVZ区作为神经元的来源？ 2、培养基中添加的因子有何作用？ 3、经过荧光染色以后，为什么阳性的神经元发绿光？ 4、Hoechst 33258的作用是什么？ * * Differential interference contrast (DIC)下的体外培养到第6 d时的神经元细胞形态，bar=100 μm 体外培养到第6 d时的神经元细胞进行β-III-Tubulin免疫荧光鉴定， H33258（蓝色）代表细胞核，bar=100 μm *