第五章 DNA序列多态性.ppt

第五章 DNA序列多态性 概 念 基因组DNA碱基序列差异是不同个体间最本质的差异。在特定基因座上等位基因之间碱基序列差异构成的DNA多态性叫做序列多态性。 重要价值： 个体识别：同一认定 同一性 分析DNA序列认定同一性的前提：同一个体不同组织细胞中的基因组DNA序列一致。 分析技术： DNA序列测定、ASO杂交技术、PCR-RFLP、MVR-PCR、SSCP 高新技术：DNA芯片、DHPLC、MALDI-TOF-MS 第一节 DNA序列测定及多态性分析 DNA测序是对DNA一级结构的分析 经典的测序的技术: Sanger等（1977）发明的双脱氧核苷酸链终止法（末端终止法） Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。 循环测序 DNA自动测序 一、 DNA测序原理及基本技术 Sanger双脱氧核苷酸链终止法 循环测序 DNA自动测序 （一）双脱核苷酸氧链终止法 1 基本原理 DNA复制基本成分和基本过程 在反应体系中加入双脱氧核苷三磷酸（ 2，，3，-ddNTP ），DNA合成过程会发生变化 合成DNA的底物是dNTP，DNA链中的核苷酸是以3，，5，-磷酸二酯键相连接。 在DNA合成的过程中，如果有2，，3，-双脱氧核苷三磷酸酸ddNTP被掺入到新生核苷酸链末端，由于其没有3，-OH，不能再与其他核苷酸形成磷酸二酯键，造成新生链的延伸特异性终止在相应的位置。 在DNA测序系统中，除了加入正常反应所必须的4种dNTP外，还加入一定比例的ddNTP， 链合成反应过程中，ddNTP和dNTP处以一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常的dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。 结果产生一系列长度不等的多核苷酸片段： 有相同的起点，引物的5′端 但有不同的ddNTP终端 ？ 2 双脱氧核苷酸链终止法测序基本技术 三个步骤： 制备测序模板 测序反应（链合成反应） 电泳分离、显带、读取序列 反应体系： 引物 单链DNA模板 标记dNTP DNA polymerase ddATP , ddGTP , ddCTP, ddTTP 模板与引物 模板：单链DNA 或碱变性的DNA 制备方法：构建重组体DNA 引物：通用引物 以靶DNA片段两侧翼的载体已知序列作为测序反应的引物。 由于克隆载体的序列是已知的，可引导任何靶DNA片段的测序反应，故被称为通用引物 模板与引物 dNTP：早期用同位素标记 非同位素标记 DNA 聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段 有完整的聚合酶活性和外切酶活性 热稳定性较Taq聚合酶差 测序反应 标准的测序反应设置4个反应管。 每个反应管对应一种碱基，除加入待测单链DNA模板、引物、标记dNTP、聚合酶外以及缓冲液外，还加入一种ddNTP，合成相应碱基为末端的系列片段。 四个管分别产生A、G、C、T四种不同碱基为末端的长度不等的片段。 一次测序：经历变性→退火→延伸一个循环的测序反应过程 电泳分离： 变性PAGE 编有A、G、C、T的4个反应管的产物分别在比邻的四个点样槽加样。 放射自显影 读取序列： 检测被终止DNA片段长度，同时确定该位置的碱基种类。 双脱氧法的缺点： 放射性 操作步骤烦琐 效率低 读片过程慢 （二）循环测序 1 基本原理 概念：基于PCR原理的测序采用了热循环高效合成DNA的特性，并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在循环过程中得到增加，因此称为循环测序。 基本步骤： PCR扩增：利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板。 模板纯化 循环测序：利用PCR直接测定序列。 每个测序循环包括：变性、退火、链延伸终止反应。 每次循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链产物在下一轮测序循环中，模板链被再次变性释放出来，作为又一轮引发反应的模板，引发引物链的退火、延伸和终止反应。 2 循环测序法