第二章：分子克隆的工具酶.ppt

平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。 提高平头末端连接效率的方法包括： ①加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接)。 ②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。 ③加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。 ④加入单价阳离子(NaCl),最终浓度150-200 mmol/L。 2.E.coli DNA 连接酶 与T4DNA ligase相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 参与 平端连接效率低，用于置换合成法作cDNA克隆（不将RNA连接到DNA,不连接RNA） 第六节 核酸酶 ( nuclease) 一、BAL 31 核酸酶 来源于Alteromonas espej iana BAL3 主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3’端去掉除单核苷酸， 还是一个内切核酸 (单链，nick, gap) 依赖 Ca++ EGTA可抑制活性 连续去除3‘端单核苷酸后形成的单链DNA，可被内切核酸活性降解 用途： 从两头缩短DNA (用于缺失突变等），活性发挥均匀，活性与酶浓度成线性关系 确定DNA二级结构 DNA限制酶切图 注：可能有单链突出，可用DNA poly补平，单链突出的长度与酶浓度有关，如：2-5u/ml, 平均有5个bases单链，10-20%保持平端 二、Sl核酸酶 来源于米曲霉(Aspergillus oryzae) 降解单链DNA或RNA，产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸 对dsDNA，dsRNA；DNA:RNA不敏感 酶量大可完全消化双链， 中量，可在切口或小缺口处切割双链 作用：用于分析DNA:RNA杂交体的结构 去掉突出的单链尾，以产生平端 打开双链cDNA合成中产生的发荚环 三、绿豆核酸酶 Mung Bean Nuclease 来源于绿豆芽 与Sl nuclease 相似 但比Sl更温和 在大切口上才切割 可使DNA突出端变成平端 CCAAGCTTGG GGTTCGAACC CCA AGCTTGG GGTTCGA ACC CCA TGG GGT ACC HindIII MBN CCATGG GGTACC NcoI 四、核糖核酸酶A RNase A （来源于牛胰） 内切核酸酶 可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端 形成 带嘧啶3’磷酸的单核苷酸或 末端带嘧啶3’磷酸的寡核苷酸 用途：除去DNA样品中的RNA 除去DNA:RNA中未杂交的RNA区 确定杂交体DNA的RNA中单突变的位置 可能污染其它酶（如DNA酶）使用前应加热 五、DNase I (来源于牛胰) 内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNA Mg2+: 独立作用于每条DNA链，位点随机 Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA 产生平端 或1-2个核苷酸突出 用途： 切口平移标记，在dsDNA上随机产生切口 在闭环DNA上引入单切口以使分子截短 （在亚硫酸氧盐介导的诱变前） 建立随机克隆，以便安插在M13 phage上测序 分析 蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法） 除去RNA样品中的DNA（RNase-free） 六、外切核酸酶III （来源于大肠杆菌） exonuclease III , Exo III １. 活性 催化从dsDNA 3’-OH逐一去除单核苷酸 底物为dsDNA线状或带切口或缺口的环状DNA，结果是在dsDNA上产生长的单链区。 无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性, RNAase H活性 3’-磷酸酶活性(去磷酸),但不降解磷酸二脂链 不降解单链DNA及3’突出dsDNA 持续作用能力不强，产物为长短不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。 2．用途： 制备部分截短的DNA,用作探针（Klenow补平）,类似T4 poly的作用 在dsDNA链上产生末端序列嵌套缺失的成套缺失体一般与绿豆核酸酶或Sl核酸酶联合应用也能制备单向缺失的DNA（如另一端为3’突出端） 定点诱变,选用dNTP的硫代磷酸衍生物在诱变引物引导下合成第二链，该酶可用于切割模板链(不切割硫酯键),以提高转化突变率 RNase T1 为内切RNase, 作用于鸟嘌呤3’ 磷酸