15-亲和-课件（PPT-精）.ppt

第15章 亲和分离技术 1 生物亲和作用 2 亲和作用的影响因素 3 一般操作 4 亲和吸附介质 5 亲和配基 6 配基连接 7 亲和作用体系 8 亲和吸附 9 亲和色谱洗脱 10 Applications 1 生物亲和作用 2 亲和作用的影响因素 1)．离子强度 如Affinity主要源于静电引力或氢键，则提高I无疑会减弱或完全破坏Affinity。 疏水性作用随I提高而增大, 因此，当Affinity作用主要源于疏水性相互作用时，增大I则可提高Affinity。 许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱，说明静电引力在Affinity中占有重要地位。 2)．pH 在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是非常重要的. 3).抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍的存在可抑制氢键 3 一般操作 4 亲和吸附介质 商品化的亲和吸附介质 4 亲和吸附介质 Home-made亲和吸附介质 Home-made所需材料 1st 亲和配基 2nd 载体 Home-made基本方法 亲和配基 + 载体 = 载体-亲和配基 5 亲和配基 A 蛋白(protein A or A抗原) 分子量约42kD，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中，占细胞壁构成成分的约5%。 A蛋白与动物IgG具有很强的亲和结合作用，每个A蛋白含有5个Fc片段结合部位。除IgG外，还与人IgG和人IgA也具有亲和结合作用，但较弱。 凝集素lectin 与糖特异性结合的蛋白质的总称(酶和抗体除外)，大部分凝集素为多聚体。如。常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A, con A)与葡萄糖和甘露糖的亲和结合作用较强,麦芽凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)与N-乙酰葡萄糖胺亲和结合作用较强。 5 亲和配基 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶需要在辅酶co-enzyme的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有辅酶I(NAD)、辅酶II(NADP)和ATP等。此外，AMP, ADP的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢和激酶同样具有Affinity。 三嗪类色素 三嗪类色素(triazine dyes)是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。这类结合具有抑制酶活性的作用。 三嗪类色素还与白蛋白、INF、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和结合能力的. 6 配基连接 溴化腈活化法 固定配基：R-NH2 应用：多糖凝胶的活化，适用于R-NH2型配基的修饰，如蛋白质配基IgG 方法：反应在碳酸盐buffer下进行， 注意： CNBr剧毒药品，且具有挥发性，上述操作南非在通橱中进行 至少二人在场 急救药品 二价铁盐 6 配基连接 环氧基活化法 应用对象： 用于多糖凝胶和表面为氨基的载体的活化，固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。 步骤： 1st 活化 2nd 直接固化法 反应速度很慢，所需固定化时间较长(24h以上) 2nd 间接固定化法 6 配基连接 硅胶上连接 活化 6 配基连接 金属配位 固定化HIS 6 配基连接 7 亲和作用体系 高度特异性亲和体系 抗原与其单克隆抗体的结合基本上是一对一的关系，即该单克隆抗体不能与其他抗原结合。 群特异性亲和体系 外源凝素可与任何含有糖基的蛋白质结合。 8 亲和吸附 8 亲和吸附 8 亲和吸附 3rd pH Value 4th 杂蛋白 9 亲和色谱洗脱 可控制的条件 1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质 8 亲和色谱洗脱 按洗脱方式分类 1st 线性洗脱 2nd stepwise洗脱(最常用） 8 亲和色谱洗脱 洗脱速度的控制 料液流速是影响柱效和分离速度的重要因素。提高流速虽可提高分离速度，但柱效降低，穿透曲线平缓，亲和色谱柱的有效利用率降低。因此，吸附操作要在适当的流速下进行，即要保证高速度，又要保证高效率。此外，琼脂糖凝胶等低强度载体容易受压变形，存在最大允许线速度。图示: 在一定操压力以上，继续增大压力流速反而降低，并且最大允许线速度随柱径和柱高增大而降低。其它层析过程同样存在类似现象，在放大设计中须特别注意这一问题。 8 亲和色谱洗脱 清洗: 目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时加入表面活性剂，保证目标产物的吸附和杂质的除去。由于亲和吸附是可逆的，清洗过度会使目标产物的损失增多，特别是对于亲和结合较弱的亲和体系，而清洗不充分则使