蛋白质研究方法.ppt

个人简介 授课内容 授课内容 授课内容 授课内容 谢谢大家的关注！ 免疫组化法 之 注意事项 5. 彻底抑制内源性过氧化物酶的活性 原因：各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，生成与阳性物一样的黄棕色，即背景染色造成混乱。在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。 对策：常用抑制剂是0.3%的H2O2。 免疫组化法 之 注意事项 6. 手工操作时注意抗体的正确加入 ① PBS冲洗完毕后，加入抗体，如一抗，二抗或三抗。除去切片上多余的PBS，但不能让切片干涸。切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。切片干涸，往往可产生非特异性染色。 免疫组化法 之 注意事项 ② 加入的抗体以一滴为佳。 当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50ul为好，加入后，轻微、摇匀覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。 免疫组化法 之 注意事项 7. 选择合适的孵育时间 按说明书操作。不主张于4℃冰箱中过夜，原因是： 1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。 2.目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好　。 3.长时间孵育，容易引起切片脱落，造成染色的失败。 免疫组化法 之 注意事项 8. PBS的冲洗 免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。 ①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 ②温柔冲洗，防止切片的脱落。 ③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 　 免疫组化法 免疫组化法与免疫印迹法比较 Western blotting 免疫组化 项目 方法 No Yes No 线性表位 有 不能 精确定量 Yes 线性表位 构象形表位 假阳性 定量 定位 一抗 免疫组化法 之 主要用途 免疫组化法 对目的蛋白进行如下研究： 定位 定性 定量 棕黄色（阳性），细胞核 免疫荧光法 4 流式细胞术 免疫印迹法 √ 免疫组化法 √ 1 2 3 1 候选蛋白质的验证 一 1 免疫印迹法 Western Blotting 实验技术 之 杂交结果的分析 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会有假阳性。 免疫组化定量分析（半定量）：用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记分为0～3 分,着色深度以多数细胞呈色程度为准。常用软件进行处理，如image?pro?plus?5.0（IPP5）。 免疫印迹法 Western Blotting 常见问题分析 Western Blotting 常见问题分析 不恰当的样品制备会导致实验失败 新手采用含TritonX-100或NP-40的缓冲液裂解组织或细胞，结果无蛋白条带。因为步骤太多，新手无法保证每一步操作都正确。SDS上样样品中蛋白实际含量较低。 Western Blotting 常见问题分析 SDS不完美 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 Western Blotting 常见问题分析 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？4，5，6，7 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 SDS不完美 Western Blotting 常见问题分析 SDS不完美 条带1、2、3、9的形状，属电泳条件比较合适的区带，其余都是电泳条件不太理想所致。 影响区带形状因素：凝胶的孔径，样品的盐浓度，蛋白质的量（如8，量太多，带向下垂），电泳过程中产生的