RNA提取及RT-PCR.ppt

RNA提取及常见失败原因 研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT-PCR、cDNA 库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。 Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 目的 主要试剂  均一和完整 — 两个关键指标 完整：最大限度避免内外源 RNase 降解—高活性RNA酶抑制剂。（异硫氰酸胍和盐酸胍） 均一：有效去除DNA和蛋白质。酚-氯仿抽提 1. Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。 2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮尘，注意配带手套，样品尽可能盖严； 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。 4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。 2-8℃ 避光保存一年。 准备工作 RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。 2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。 处理的步骤如下： 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用） 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。 将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸 汽灭菌至少30分钟。 灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。 （2） 玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。 DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。 试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。 但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。 DEPC(二乙基焦碳酸酯) 乳腺癌细胞系： (I) MDA-MB-231 (II) MCF-7 内参基因：ＧＡＰＤＨ（451bp） 目的基因：Survivin （812bp） 实验材料 实验步骤（一）总RNA提取的 细胞用胰酶消化，300g离心5min，吸尽上清 PBS洗2次 加入1mlTRIZOL，充分震荡混匀，室温放置5min 加入0.2ml氯仿，充分震荡，室温放置5min 12000rpm离心15min，将上层无色水相转移至一EP管 加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min 4℃ ，12000rpm离心10min，弃上清。沉淀即为总RNA 加入75%乙醇，轻轻洗涤（必要时 4 ℃ ，10000rpm离心5min）吸干乙醇，风干 加入15μl无RNase的55～60 ℃的水，溶解RNA，吸光度法测定总RNA浓度 （取5μl 上述RNA加ddH2O至100μl） 13. RNA检测 (1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。 OD260/OD280在1.8-2.0 。 (2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定 RNA的完整性和污染情况。