专题-序列分析和引物设计幻灯片.ppt

测序序列 如何确定是否为目的序列？ 如何去除载体序列？ 如何转换成有义链？ 如何找到序列起始和终止位置？ 去除序列中此数字之后的序列，一般为载体序列 ＰＲＩＭＥＲ５.０的常规应用 3. MEGA3.1软件的应用 甲基化引物的设计 何谓甲基化？----亚硫酸氢盐----C变T 准确寻找甲基化位点，至少一个，多多益善 设计野生型对照 CpG位置尽量靠3‘端 一段基因组的序列是： 5-GAGGGGCGGCCGCACCGGG-3 甲基化引物：5-GAGGGGCGGTCGTATCGGG-3 非甲基化引物： 5-GAGGGGTGGTTGTATTGGG-3 “Ctrl+V”输入序列 也可以把上下游引物分别设在序列的某一特定位置 界定产物长度 界定引物长度 在55-65之间调整 简并性引物的设计 1.基于保守性的简并位置选择（3‘端尽量不设置简并） 2.用Primer 5.0检测大致的评分（主要看Tm值和发夹结构和引物二聚体情况） 复制 同源克隆---基于不同物种（范围较广）相应序列保守区的引物设计---通过已知序列信息钓取未知的同源基因 “Ctrl+V”输入引物序列 上游引物 下游引物 简并引物的确定（上游） 5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3 如确定该位置为下游引物 3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5 表达引物的设计 ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC 起始 信号肽编码区 N端编码区 终止 ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-------------------------------------------------------------------------------------GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC ATGTCGGACGAAGCCGTACGTA 上游引物的设计 添加ATG起始密码子 5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3 添加酶切位点 1. 编码区内不含该位点 2. 5’端添加保护碱基2-3个（网上有规律表） 3. 不能造成下游的移码 去除信号肽编码区部分 1.位置必须选择含终止密码子子位置或终止密码子之后不远的一部分序列， 2.记得要是有义链的反向互补链， 3.同样加酶切位点和保护碱基 下游引物的设计 定量引物的设计 扩增长度：100-300 bp范围即可 以mRNA为模板进行设计 尽量避免引物二聚体、发夹结构等的出现 引物设计避免DNA污染可能带来的干扰，最好跨外显子接头区 Tm值在58-62度 内参引物设计：选取持家基因，如18SRNA、actin等 长度与特异基因有所差异 设计范围在编码区内 界定产物长度在100-300bp 应用Primer 5.0软件常规应用功能即可 标记引物的设计 （特异性） 选择非保守区段，特异性的位置设计在3‘末端 ；（SSR等特征序列的两侧） 特异区段 RACE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段 RACE引物的设计 如果基因是多拷贝或为多基因家族，须在所得不同片段特异区设计 与接头引物Tm值相差不宜过大 产生嵌套引物，位置合理 SNP引物的设计 何谓SNP？ SNP位点设置在3‘最后一个碱基 倒数第三个碱基人为引入突变----保证引物特异性 5-CTAGGTACTGGATTAGT-3 此图对于设计体外表达引物或转基因载体构建引物十分重要。原则为：设计引物添加酶切位点必须是目的基因中没有的酶切位点。 多序列比对 应用： 简并引物设计 差异位点分析（SNP或氨基酸差异等） 进化树的构建 保守区 DNAMAN1形式 DNAMAN2形式 GCG形式 GDE形式 选择某区段 引物设计专题 分子生物学实验基础之 生物科学技术学院 郭志富 2011年11月8日 简并引物设计：基于保守区设计，用于保守区片段（或中间片段）获得 定量引物设计：用于半定量和实时荧光定量PCR 标记引物设计：基于特异区设计，用于标记特异基因或特异物种材料。 表达引物设计：用于原核体外表达、真核表达（转基因） SNP引物设计：