第4章 利用酵母生产蛋白质.ppt

第四章 利用酵母生产蛋白质 发展历程 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想 糖基化作用(Glycation) 糖基化作用是将寡糖连接到蛋白质分子上，是真核生物细胞在进行基因产物生产时最重要的一种翻译后修饰。 蛋白质糖基化修饰主要有N-连接的糖基化和O-连接的糖基化两种类型。前者寡糖基直接连接的氨基酸残基是天冬酰胺（Asn），后者主要是丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr），此外也可能是羟脯氨酸和羟赖氨酸（如胶原蛋白）。 简写 SA,N-乙酰神经氨酸，别名唾液酸；Gla,D-半乳糖；GlcNAc,N-乙酰氨基-D-葡萄糖；Man,D-甘露糖；Fuc,L-盐藻糖；Xyl,D-木糖；P,磷酸盐；GalNAc,N-乙酰氨基-D-半乳糖。虚线箭头指部分取代物。 糖蛋白中已发现寡糖基的类型 氨基酸残基的酰化作用 在许多真核生物蛋白质中，N端氨基酸残基的氨基被酰化作用所修饰，也就是说，用一个酰基进行酰胺连接。 原核细胞和真核细胞的蛋白分泌途径 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。 4.1 DNA导入酵母细胞 (1)原生质体转化法 (2)LiCl转化法 (3)电穿孔法 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷互补基因和显性基因两大类。前者主要包括营养成份的生物合成基因，如氨基酸（LEU、TRP、HIS和LYS）和核苷酸（URA和ADE）等 ；显性标记基因的编码产物主要是干扰酵母菌受体细胞正常生长的毒性物质的抗性蛋白 ，如G418抗性基因，CAT抗性基因等。 酵母菌的转化程序 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。 原生质转化法德一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的25%-33%。 酵母菌的转化程序 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有以下特性： 吸收吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍。 共转化现象较为罕见。 酵母菌的转化程序 酵母菌电击转化 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达105转化子/μgDNA。 4.2 酵母的克隆载体 在酵母细胞中用于构建DNA重组子的克隆载体大多数是“穿梭”质粒，即在酵母和大肠杆菌中都能复制的载体。 酵母的克隆载体一般有五种主要类型：酵母整合质粒(Yip)、酵母复制质粒(YRp)、酵母游离质粒(Yep)、酵母着丝粒质粒(YCp)和酵母人工染色体(YAC) 4.3 酵母中外源基因表达的增效作用 (1)质粒拷贝数 (2)启动子序列 (3)转录终止和mRNA的聚腺苷酰化作用 (4)mRNA的稳定性 (5)启始密码AUG的识别 (6)多肽链的延长 (7)外源蛋白的折叠 (8)蛋白质的降解 (9)糖基化作用 实例：乙型肝炎病毒表面抗原 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染能力的病毒颗粒，直径42n