百合杂交后代亲本基因型鉴定-西南大学.docVIP

百合杂交后代的亲本基因型鉴定 于晖1，赵泓2，王力超1，王贤2﹡ 1．西南大学园艺园林学院，重庆400715；2．北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097 摘要：利用基因组原位杂交技术和SRAP分子标记技术对来源于O、A、L基因组、但亲本基因型未知的20个百合杂交种进行亲本基因型的判断。有14个杂种株系只具有A基因组，说明它们的亲本均为亚洲百合杂种系；有6个杂种株系只具有L基因组，说明它们的亲本均为铁炮百合杂种系，这20个杂种株系全部来自种内杂交。待测株系中没有东方百合杂种系的后代。根据SRAP带型整理汇总得到的分子聚类分析结果与GISH鉴定结果一致。GISH和SRAP两种检测方法的侧重点不同，同时使用这二种检测方法不仅提高了鉴定结果的可信度，而且也为百合杂种后代亲本基因型的判定提供了新的手段。 关键词：百合；基因组原位杂交；SRAP 百合(Lilium spp.)属百合科百合属多年生球根花卉植物，是世界五大鲜切花之一,在世界鲜切花市场占有十分重要的地位。现在8000多个百合品种主要由东方百合(Oriental Hybrids) 、亚洲百合(Asiatic Hybrids) 和铁炮百合(Longiflorum Hybrids)三大品种群构成。百合属共有80余种,依其生物学特性分为7组,即: Lilium, Martagon, Pseudolirium, Archelirion, Sinomartagon, Leucolirion和Oxypetala [1]。一般情况下,百合组内的种间杂交较易成功且杂种可育,而组间杂交比较困难且杂种高度不育[2]。东方百合、亚洲百合和铁炮百合三大品种群就分别源于Leucolirion, Sinomartagon和Archelirion的组内种间杂交[3]。 培育性状优良，商品价值高的新品种已经成为百合育种工作的重点。杂交育种能够整合二个亲本的优良特性，是创造新型种质的重要育种手段。百合杂交育种主要存在两个问题，一是生长周期长[4]，从种子播种到开花要经历3-4年时间。二是种间杂交困难。百合 杂交育种普遍存在不亲和性的问题，不仅受精困难，而且受精后很难获得种子，这成为百合杂交育种主要的限制因子之一。正确选择亲本并予以合理组配是杂交育种成败的关键。 本实验待检的20份杂种株系性状优良，准备作为候选亲本参加新组合的试配研究。为了提高杂交育种的成功率，必须要了解这些基础材料的遗传背景。基因组原位杂交技术(GISH)可以鉴定材料的染色体组成和基因组类型，SRAP分子标记可以在一定程度上体现材料间的差异。 GISH作为植物分子细胞遗传学研究的重要手段，以其安全、准确、直观、信息丰富的特点，被广泛地应用于杂种染色体分析，物种的起源、进化和亲缘关系探索以及染色体行为考察等方面[5]。目前已经有很多关于百合基因组原位杂交的研究，G.I. Karlov在1999年应用GISH技术将百合O、A、L三个基因型区分开[6]，周树军在2003年应用GISH技术将东方百合和亚洲百合杂种的回交一代鉴别出来[7]，并在2008年将东方百合和铁炮百合的杂交后代鉴别开来[8]。 近年来,分子标记技术被广泛应用于杂交后代真实性的鉴定。序列相关扩增多态性（SRAP）锦葵科 基金项目：国家科技计划项目2009BADB8B04） 收稿日期：2010.4 作者简介：于晖（1983- ）女，山东招远人，硕士，主要从事生物技术与花卉遗传育种研究 通讯作者：王贤（1969- ）女，北京，硕士，副研究员，主要从事花卉栽培育种研究 实验材料来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心花卉组，包括20个百合杂种株系和3个对照(见表1)。对照分别为亚洲百合杂种系Pollyanna、东方百合杂种系Sorbonne和铁炮百合杂种系White Heaven。20个百合杂种待测株系全部是由O、A、L三个杂种系种内杂交或种间杂交得到的后代，它们的编号分别为A1-A16、B1-B4。 1.2 方法 1.2.1 基因组原位杂交 DNA提取：采用CTAB提取法[18]，去除RNA后测其浓度和纯度。 染色体制片:早上取0.5-1.0cm的根尖用饱和对二氯苯室温处理4h[19]，置于新配置的无水乙醇-冰醋酸（3﹕1）固定液中室温固定24h。5%纤维素酶和5%果胶酶混合液中酶解37℃3 h，低渗10 min后用60﹪冰醋酸压片，放入-80℃冰箱中2h后去除盖玻片[20]，用DAPI镜检后选择分裂时期为中期的制片保存备用。 探针制备：将三个亲本的DNA打碎成1-10KB左右的片段[21]，用DIG Nick Translation Mix 试剂盒(Roche)标记。鲱鱼精子DNA处理为500-600 bp的片段[22]。 杂交液的制备：每张制片35μL杂交液，其中含2 ng/μ