高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化.pdfVIP

微生物学通报 Oct. 20, 2016, 43(10): 2121−2128 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150912 研究报告 高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及 重组菌的细胞催化 张晓欢 崔文璟 周哲敏* ( 214122) 摘 要：【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1 来源的高分子量腈水合酶H-NHase 在 Escherichia coli BL21(DE3) 中过量表达，以提高菌体总酶活，缩短菌体发酵周期，提高生产效 率。【方法】将H-NHase 中编码α 亚基的基因nhhA 和调控基因 nhhG 上游的核糖体结合位点 (Shine-Dalgarno sequence ，SD)替换成翻译起始强度更高的异源SD，同时优化各亚基之间间隔 序列的长度，并根据大肠杆菌密码子偏好性对目的基因进行优化。通过E. coli 重组表达系统过 表达优化后的腈水合酶基因。采用离子交换层析对H-NHase 进行纯化，并通过凝胶过滤层析确 定重组酶的相对分子量。优化了全细胞催化条件，并建立底物恒速流加的细胞催化工艺，模拟 了烟酰胺的生产工艺。【结果】H-NHase 在E. coli 中实现了过量表达。重组蛋白粗酶液的活性 为85.5±4.3 U/mg ，纯酶比活为234.0±11.7 U/mg ，H-NHase 相对分子质量为504.5±9.8 kD。细 胞催化最适pH 为7.5 ，最适温度为25 °C ，底物浓度为400 mmol/L 。在此条件下，重组菌细胞 酶活为256.0±10.4 U/mL ，流加工艺最终的产物转化率可达99.9%。【结论】重组H-NHase 大肠 杆菌细胞生长迅速，发酵周期短，应用此重组菌进行细胞催化可以提高酰胺类物质的生产效率， 具有潜在的工业价值。 关键词：高分子量型腈水合酶，密码子偏好性优化，SD 序列，间隔序列，重组表达，细胞催化 Strategy of high molecular mass nitrile hydratase expression in Escherichia coli and the whole-cell catalysis by the recombinant strains * ZHANG Xiao-Huan CUI Wen-Jing ZHOU Zhe-Min (Key Laboratory of Industrial Biotechnology (Ministry of Education), School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: [Objective] To increase the activity of the whole-cells, reduce the fermentation period and improve production efficiency, high molecular mass nitrile hydratase (H-NHase) from Rhodococcus Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. *Correspo