实验三 微生物分离和纯化［张理珉］.ppt

实验三 微生物的分离和纯化 目的要求 1、掌握一定的无菌操作技术（包括上次实验中培养基及实验用具的灭菌），了解无菌（洁净）空间的实现手段和方式。 2、掌握倒平板、制斜面的技术和方法。 3、掌握几种分离纯化微生物的原理及基本操作技术和方法。 实 验 内 容 一无菌操作技术知识介绍 一、无菌操作技术的概念 指防止微生物进入机体或其他物品的操作技术，具有两方面的要求。 防感染——针对生物体（包括操作者）。 防污染——针对培养物、实验所用物品和实验室空间等。 针对人来说，还要解决防止双向交叉感染操作的问题——人对培养物等的污染；培养物对人的感染。 实验室中如何实现？ 二、污染来源 空气（空间）——实验室、车间、生产场所等； 实验用器材——实验用具、器皿、器械、试剂、药品等； 实验材料——实验用材料和样品本身携带； 人体——衣服、毛发、皮肤表面、和外界相通的腔道等 三、无菌操作技术建立的理论依据和过程 路易斯·巴斯德（Louis Pasteur, 1822---1895 ） 曲颈瓶实验 否认“自然发生学说” 建立“种胚学说” 曲颈瓶试验过程 约瑟夫·李斯特（Joseph Lister 1827~1912） 发明和推广外科防腐技术的外科专家 。 认真仔细洗手； 使用的手术器材和敷料做彻底的卫生处理（高温消毒）； 向手术室空中喷洒石炭酸 （空气消毒）； 病人的伤口要消毒，要包扎绷带； 医生要穿洁白的衣服。 使用手术后死亡率由45 ％减少至 15 ％（1889年）。 十九世纪外科手术的场景 四、现今无菌操作技术的介绍 世界各国洁净度等级对照表 生物安全实验室分级 中国药品生产洁净室（区）的空气洁净度标准 五、设备及设施介绍 具有高效过滤器（HEPA） 过滤器级别： HEPA过滤器（标准） ；ULPA过滤器 达到的洁净等级—— HEPA：ISO 5级（美联邦209E标准100级）； ULPA：ISO 4级（美联邦209E标准10级） 过滤效率—— HEPA：99.999%（0.3 μm ）；ULPA：99.9999%（0.12μm） 水平流和垂直流超净工作台 WD-9409型 桌面式洁净工作台 生物安全柜 生物安全柜的要求（A2） 针对垂直下降型层流风向方式； 气幕隔离式设计，防止内外交叉污染，提供对产品及操作者、环境的双重保护功能； 有专门的空气处理系统（无害化处理外排）。 生物安全柜和生物安全实验室 风淋门 洁净手术室 吹淋 洁净传递窗 洁净病房 六、无菌操作规范（11步） 1.?? 打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒半小时以上。 2.?? 进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。 3.?? 穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。 4.?? 风淋2分钟。 5.?? 0.1%过氧乙酸水（新洁尔灭）泡手，擦干。 6.?? 点燃酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。 7.?? 打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。 8.?? 垂直式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。 9.?? 同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系或微生物菌种；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。 10.?? 漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。 11.?? 操作完毕后恢复工作台面，并进行必要消毒灭菌。 七、中华人民共和国国家标准洁净厂房设计规范 总体设计（洁净厂房位置选择和总平面布置、工艺布置和设计综合协调、噪声控制、振动控制） 建筑（人员净化和物料净化设施 、防火和疏散 、室内装修 、装配式洁净室等） 空气净化（洁净室正压控制、气流组组织和送风量、空气净化处理、采暖通风、风管和附件） 给排水 工业气体管道 …… 制药企业洁净车间过道、车间内部和设备 八、无菌操作技术的介绍及演示（实验室） 实 验 内 容 二平板和斜面的制备 一、培养基融化，倒平板和制备斜面 1、牛肉膏蛋白胨培养基： 冷却至60℃左右，倒平板。 2、马丁氏培养基： 冷却至60℃左右，加入链霉素至终浓度30μg/ml，混匀后倒平板。 3、高氏1号培养基： 冷却至60℃左右，加入3%K2Cr2O7 0.7ml / 500ml，混匀后倒平板。 每组倒13~17个平板（根据各班次组数具体安排）； 装若干支斜面试管（灭菌后摆放斜面），每种培养基统一制作（牛肉膏100支、马丁氏45支、高氏1号45支）。 和其它组交换8个平板（自已组没有的2种培养基平板，各4个），用于稀释涂布平板法操作