宿主转录因子在猪瘟病毒持续性感染过程中的表达变化研究.doc

宿主转录因子在猪瘟病毒感染过程中的表达变化研究 猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）]。我国对猪瘟的防控采取猪瘟兔化弱毒疫苗的强制免疫，降低了猪瘟的发病率和死亡率，但是CSFV仍然在猪群中持续性存在，当猪群的群体免疫水平下降时，会再次引起猪瘟的爆发和流行，给养猪业造成严重的经济损失。 病毒是一种高度依赖于宿主细胞进行复制的病原微生物，它们除了自身编码蛋白拮抗宿主免疫体系外，还可以通过影响宿主细胞转录因子的表达来干扰宿主的免疫防御，达到尽可能的生存。大量研究证实很多病毒都可以通过操纵转录因子来调控宿主蛋白的表达，因此，转录因子是病毒与宿主相互作用研究中的一个热点[,,]，然而，目前对CSFV调控宿主转录因子的表达和对此造成影响的研究报道甚少。本研究利用猪基因组芯片分析了CSFV感染猪后所引起的外周血单个核细胞转录因子的动态表达变化情况，筛选到37个表达差异的转录因子，如Kruppel样因子4、热休克因子结合蛋白1、干扰素调节因子7等，揭示了CSFV通过调控转录因子的表达来实现免疫逃避而获得持续性感染的分子机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物和病毒 5头75日龄健康的三元杂猪，试验前分别用RT-PCR或PCR和ELISA检测为CSFV、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪伪狂犬病毒核酸和抗体阴性。试验猪单栏饲养，自由采食、饮水。CSFV强毒石门株来自中国兽医药品监察所。 1.1.2 试剂和芯片 Trizol购自Invitrogen公司；PrimeScriptTM 1st strand cDNA合成试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；RealMasterMix (SYBR Green I)购自天根生化（北京）科技有限公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；猪基因组芯片、GeneChipIVT Labeling 试剂盒为Affymetrix公司产品；其它试剂为国产或进口分析纯。 1.1.3 主要仪器 MJ AL079721荧光定量PCR仪（美国MJ公司）；ND-1000紫外分光光度计（美国Thermo公司）；芯片杂交炉640、芯片流控站 450、基因芯片扫描仪 3000（美国Affymetrix公司）；Advia 120 血液细胞分析仪（德国拜耳公司）。 1.2 方法 1.2.1 实验猪的病毒感染 3头猪每头肌肉注射1 mL含CSFV强毒石门株最小致死量1×106TCID50，另2头肌肉注射1mL ，作为试验阴性对照。每日直肠测温记录猪的临床症状。为了避免猪在实验过程中所出现的个体差异，因此芯片杂交采取自体分析的方法进行，在攻毒前4天对组猪进行无菌前腔静脉采血，分离PBMC），作为芯片杂交的阴性对照。在攻毒后的第1、3、6和9天分别前腔静脉采血，用Advia 120 血液细胞分析仪对分离PBMC，作为CSFV感染的阳性样本。 1.2.2 PBMC的分离 从猪前腔静脉无菌采抗凝血10mL，用等量的PBS稀释，取5 mL上述稀释液缓慢地加入含有5 mL的淋巴细胞分离液的离心管中，2000离心20。将中间细胞层移至另一离心管中，加入等量的PBS混匀，2000离心20，去上清，沉淀细胞加入9 mL的红细胞裂解液（0.15 M NHCl4，10mM NaHCO3）去除污染的红细胞。1000/min离心5，去上清，沉淀细胞用PBS洗涤。同上再离心、洗涤3次，最后用PBS将PBMC稀释为1×107个/mL。分离得到的PBMC经瑞氏-吉姆萨染色，光学显微镜下观察其纯度99%。1.2.3 芯片杂交试验 nase I在37℃作用15 min，除去污染的DNA。紫外分光光度计测定样本RNA的浓度和纯度，并将RNA进行电泳，样本RNA电泳时其28S和18S的亮度为1～2:1时，则可用于芯片杂交试验。 首先将1 μg总RNA℃杂交16 h，杂交结束后冲洗芯片，最后在芯片流控站 450内用亲和素标记的藻红蛋白进行染色，由基因芯片扫描仪 3000读取荧光信号。 1.2.4 芯片数据分析 1.2.5 荧光定量PCR验证芯片杂交数据 μg）进行反转录后，以cDNA为模板进行PCR反应0 μL，包括RealMasterMix 9 μL、上下游引物(mol/L)各μL、cDNA模板2 μ以及ddH2O μL。反应条件为：95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 20 s60℃20 s，68℃20 s的循环；最后68℃ 5 min延伸。选取干扰素调节因子（IRF）3, IRF-7, TBK1、C-JUN, CREB1等5个转录因子用于验证试验，以看家基因GAPDH作为内参基因，每个样品设3个重复，根据2-??Ct方法计算基因表达相对变化倍数。 2 结果 2.1 实验猪感染CSFV后