基因操作的基本技术I－电泳技术.DOC

第三章 电泳技术 实验一 核酸(DNA或RNA)的琼脂糖凝胶电泳 一、原理和用途 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUCl9质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA (covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA (open circular DNA，简称OCDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂 (1inear DNA，简称L DNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒—DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳是DNA不同长度片段分开常用的方法，根据DNA的长度不同，常用的琼脂糖凝胶浓度也不同（见表3－1） 表3－1 琼脂糖凝胶浓度与可分离的DNA长度片段范围 琼脂糖凝胶浓度 (%) 片段可分区域 (kb) 0.3 5～60 0.6 1～10 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～3 2.0 0.1～2 二、实验材料 分离纯化的核酸(DNA或RNA)。 三、溶液与缓冲液 10×TBE 缓冲液 900 mmol/L Tris 900 mmol/L 硼酸 100 mmol/L EDTA pH 调至 8.0 高压灭菌 用时可稀释为0.5×或1×TBE 缓冲液用。 10 mg/mL溴化乙啶染色液 溴酚蓝电泳加样缓冲液 0.25 ％ 溴酚蓝 0.25 ％ 二甲苯青FF 40％ （W/V）蔗糖水溶液 4. λ-DNA Marker/HindIII(片段：23.1，9.36， 6.56，4.35，2.32， 2.03， 0.56，0.13 kb) 四、仪器设备及耗材 电泳仪，电泳槽，凝胶板槽，胶梳子，微波炉，电子天平，旋涡振荡器，小型高速离心机，凝胶成像仪或紫外透射议，高压灭菌锅，离心管架，吸头盒，2 μ L、 10 μL、100 μL 移液器，10 μL、200 μL 吸头，1.5 mL 离心管，胶带纸等。 五、实验方法 将凝胶槽擦洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。 0.8 g琼脂糖悬浮在100 mL 1×TBE缓冲液中，微波炉中2～4 min 溶解。 当溶液温度降至60℃时，加入溴化乙啶溶液，至终浓度为0.5 μg/mL，混匀。 立即将琼脂糖溶液倒入胶槽。注意：不要出现气泡！ 等凝胶完全冷却凝固（即约30～45 min）后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移置到电泳槽中。 给电泳槽中加入0.5×或1×TBE缓冲液至高出胶面2～5 mm. 给每个样品加入5 μL的溴酚蓝溶液，混匀。 DNA Marker：18 μL TE缓冲液，5 μL溴酚蓝溶液，2 μL 0.5 μg/μL λ - DNA Marker/HindIII, 混匀。 将样品和λ-DNA Marker/HindIII，分别加到凝胶的样品孔中，一般DNA Marker 加在两边。 72 V 电泳约2～5 h或 36 V 电泳2～10 h。 在紫外透射仪上观察，如果电泳很好，可照相，作进一步分析，或者作Southern 印迹等。 注意：溴化乙啶是一个很强的诱变剂并有中度毒性。使用含有该染料的溶液时，要带上手套，其用后的溶液和凝胶要统一收集处理。 六、作业与思考题 DNA的分子大小与迁移速率的关系如何？ 琼脂糖凝胶浓度对DNA电泳有何影响？ 不同构型的DNA 在琼脂糖凝胶电泳时的速率相同吗？ 实验二 核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、原理和用途 丙烯酰胺是一单体结构，由过硫酸胺提供并被TEMED（N, N, N, N′－四甲基乙二胺）N′－亚甲基双丙烯酰胺参与聚合反应，使得链与链之间交联成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比，其制备和操作相对困难，需要在垂直电泳槽中进行；但聚丙烯酰胺凝胶在分离小片段DNA分子时效果很好，其分辨率极高，相差1 bp的DNA片段都能分