引物设计技巧及优化_生工生物技术讲座.pdf

PCR引物与探针设计 上海生工 曹霞 • 目录 1 背景 2 引物设计与分析的软件 3 DNA合成及常见问题 4 引物设计及合成网址和邮箱 •背景 PCR原理 引物设计流程 Step by step 基因序列查找 PCR类型确定 引物设计 引物评估 实验鉴定 基因的查找 进入NCBI 主页：/search 后面 选择Gene，在for 后面填写需要查找的基因的名字。如图 所示： 选择 gene 输入基因名称 点击“Search”，出现以下界面： 基因的全称 基因的物 种来源 点击序列1的DDR1出现页面如下图所示（部分页面）： 设计引物之前知道需要确定PCR类型 普通PCR SNP鉴定 Real-time PCR RT-PCR 荧光定量探针 引物的作用（基因获得、测序、检测等） 引物设计与分析软件 引物设计软件 • Primer 3 plus • Oligo 6.22 • Premier 5.0 • Primer Express 3 引物分析软件 • Primer 5 • Oligo 6.22 • Primer-Blast 引物设计需考虑的问题 引物长度: • 太短—低的特异性，结果可导致非特异性扩增。 • 太长—在退火时，可能导致与模板结合效率低，发卡结构 的发生。 合适长度： • 18-24 bp适合普通PCR扩增。 • 30-35 bp适合多重PCR扩增。 产物大小： • 300-1000 bp适合普通PCR ，避免 3 kb • 50-150 bp适合real-time PCR ，避免 400 bp 引物设计需考虑的问题 序列Tm值:上下游引物的Tm值（melting temperature ）是 寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50 %寡核 苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值 5~10 ℃。若按公式Tm= 4 （G+C ）+2 （A+T ）估计引物的 Tm值。 合适的Tm值： • 52 ℃- 60 ℃。 • 65 ℃以上避免。 • 75 ℃- 80 ℃来扩增高GC含量的片段。 上下游引物Tm值的错误： • 上下游引物Tm值错误，可能导致扩增失败。 • 上下游引物Tm值相差最好 3 ℃。 引物设计需考虑的问题 引物错配： • 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相 似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率 增加。 引物特异性： • 引物设计完成以后，应对其进行Primer-BLAST检测。如 果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了 。 • 设计跨内含子的引物，为了将从基因组DNA和cDNA扩增 的条带区分开来 。 引物设计需考虑的问题 引物GC含量 • GC含量一般40-60% 。GC含量太低导致引物Tm值较低， 使用较低的退火温度不利于提高PCR 的特异性，GC含量太 高也易于引发非特异扩增。 引物自身及引物之间不应存在互补序列 •