蛋白质一级结构的测定及其进展.ppt

蛋白质一级结构及其序列分析 蛋白质一级结构的相关概述: 蛋白质一级结构与生物学功能 测定蛋白质一级结构的重要意义: 蛋白质一级结构测定的战略: 蛋白质一级结构测定的步骤: 蛋白质一级结构的概述: 研究蛋白质结构与功能的关系是目前分子生物学的中心课题之一. 1953年英国人F.Sanger首先第一个完成牛胰岛素的测定工作.同时此人还是第一个搞清ф× 175 phage DNA的一级结构的学者,为此两次获得诺贝尔奖. 1969年,基本与应用化学国际联合会规定以各种氨基酸按一定的顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质的基本结构. 1. 多肽链的数目; 2.每一条多肽链末端氨基酸的种类; 3. 每一条多肽链氨基酸中氨基酸的数目、种类和排列顺序; 4. 链内二硫键的位置和数目 5. 链间二硫键的位置和数目 蛋白质一级结构与生物功能 蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识; 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 如:牛胰核糖核酸酶的复性实验 基因工程中包涵体的问题 蛋白质一级结构与分子进化的关系; 细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序差别越大. 一级结构与遗传病(分子病); 镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β-链上第六号的Glu变为Val ，从而导致生物功能上的巨大差异 多肽激素功能以及作用； 酶原激活与激素原的激活； 酶原与激素原均是酶和激素的前体，均无生物活性，但经过特殊处理如激酶作用，肽段切除，氨基酸的置换等则可使其具有生物活性。 蛋白质工程研究发展； 利用一级结构决定高级结构的知识在蛋白质工程中广泛应用 测定蛋白质一级结构的重要意义 用来研究其结构与功能的关系; 可用于分子克隆中寡核苷酸的制备 为cDNA推导的氨基酸序列提供证据 为重组DNA技术产生的蛋白质作指纹分析 蛋白质的完整结构鉴定 确定翻译后修饰的位点 决定簇的定位 二硫键的确定 蛋白质一级结构测定的进展 1953年的Sanger测定胰岛素全部氨基酸序列 蛋白质测序的基本思路与测定氨基酸序列的化学法与酶法 1967年推出基于Edman机理的液相（旋转杯）自动蛋白质测序仪 1970华裔科学家张瑞耀采用DABITC试剂（4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-4`-异硫氰酸酯）与PITC 偶联提高灵敏度 1970年代推出固相序列分析仪，弥补液相序列分析仪不适合分析小肽（＜30个残基的肽）不足 1980年代Hewwick推出气相序列分析仪 1980年代通过测定DNA顺序推出蛋白质序列 1980年代质谱技术在蛋白质序列测定中应用 目前蛋白质的一级结构通过经典测定方法已经搞清近几百种 目前蛋白质的一级结构测定可上千个氨基酸,如牛皮胶元(1052) 、 RNA polymerase(1407) 蛋白质序列数据库大多来源于DNA推导序列 蛋白质一级结构测定的战略 从DNA开始推蛋白质的氨基酸顺序 从蛋白质开始进行蛋白质序列分析 质谱法测定蛋白质一级结构 从DNA推测蛋白质的氨基酸顺序 目的蛋白的N、C末端均已知 目的蛋白的N末端已知 目的蛋白的N、C末端均不知 从蛋白质开始进行氨基酸的序列分析 序列分析的关键： 1 蛋白样品的纯度； 2 氨基酸组成与分子量关系； 3 重叠(序列的重建) 也有一些特例：组蛋白和一些同功酶 蛋白质一级结构测定的关键步骤 二硫键的拆除与大片肽段的分离; 末端分析; 多肽的一次性降解; 肽段氨基酸的序列测定; 二硫键位置的确定; 二硫键的拆除与大片肽段的分离 1 直接拆除并固定-SH(过甲酸氧化) 2 拆除后再固定(利用还原剂还原) 3 大片段的分离 1 直接拆除并固定-SH(过甲酸氧化) 两个-SH全部能转变为磺酸基(被氧化的Cys称为磺基Ala) 过甲酸是强氧化剂,Met Trp也可能被氧化 低温,过甲酸的浓度,一般不超过10% 反应不可逆 2 拆除后再固定(利用还原剂还原) 1) β -巯基乙醇还原: 还原剂处理前需用变性剂处理蛋白 反应可逆 β -巯基乙醇浓度必需在0.1-0.5mol/L 2) Cleland试剂的还原: Cleland试剂指的是二硫赤苏糖醇,二硫苏糖醇。 还原能力上是较强的试剂,只要0.01M就使-S-S-还原, 在许多球蛋白反应中可以不用变性剂. 蛋白质或多肽末端分析 N端分析 C端分析 N端分析: 丹磺酰氯法(dansyl-cl) ;灵敏度高,一般氨基酸都是可以的.但对H、R 、W 、C不完全成功;D 、N 、E、 Q不能分,生成强荧光