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三羟异黄酮对结肠癌细胞株HT29影响 　 作者：闫金辉 谢立群 张丽华 【摘要】 目的 探讨三羟异黄酮对只表达ERβ的结肠癌细胞株HT29增殖和凋亡的影响。方法 体外贴壁培养结肠癌细胞株HT29，给予不同浓度的三羟异黄酮，测定生长曲线，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验法观察HT29生长增殖情况，用流式细胞仪测定HT29的细胞周期和凋亡率。结果 不同浓度的三羟异黄酮具有显著抑制细胞的增殖作用，并呈浓度时间依赖关系。三羟异黄酮可明显影响结肠癌细胞株HT29的细胞周期，其中G0/G1期细胞比例逐渐减少，G2/M期细胞比例明显增高，阻断细胞生长于G2/M期。另外三羟异黄酮可诱导结肠癌细胞株HT29凋亡，且随浓度增大，凋亡率增加，最高达38.96%。结论 三羟异黄酮能显著抑制结肠癌细胞株HT29的生长，其增殖抑制作用呈浓度时间依赖关系。三羟异黄酮具有保护正常结肠上皮细胞、抑制肿瘤生长的作用。 【关键词】 三羟异黄酮;HT29;细胞凋亡 大豆经加工、微生物发酵或体外酸的水解作用，染料木黄酮的糖苷部分脱离，释放出游离形式的三羟异黄酮(染料木黄酮)和二羟异黄酮(黄豆苷元)，这两种形式可被肠道有效地吸收〔1〕。这些植物雌激素，经各种渠道进入人体后影响许多靶器官的生长、分化和功能。而雌激素与大肠癌的关系一直存在争议。有研究发现植物雌激素与雌激素受体β(ERβ)具有较强的亲和性〔2〕。本研究选用表达ERβ、不表达雌激素受体α(ERα)的结肠癌细胞株HT29作为研究对象，用植物雌激素三羟异黄酮来干预其生长，以探讨三羟异黄酮对只表达ERβ的结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 结肠癌细胞株 中南大学湘雅医院肿瘤研究所引自美国ATCC。 　　1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养基：Gibco公司;常规配制RPMI1640培养液;小牛血清：Gibco公司，已灭活补体，-20℃保存;0.5%MTT溶液：Gibco公司;0.25%胰蛋白酶：Sigma公司;三羟异黄酮：Alex公司，分子量270.2，纯度为98%;碘化丙啶(PI)：Sigma 公司;SP酶免疫试剂盒，DAB显色试剂盒，福州迈新生物技术公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 结肠癌细胞株HT29常规培养于含有10%小牛血清，50 IU青霉素和50 mg链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。 　　1.2.2 分组 用二甲基亚砜(DMSO)将三羟异黄酮配制成浓度分别为0、10(G1)、30(G2)、90 μmol/L(G3)的母液处理细胞，即分别为对照组、低、中、高浓度组。 　　1.2.3 生长曲线的测定 以5×104/ml 细胞密度接种于24孔培养板中，每一浓度设3个平行孔，经不同浓度的三羟异黄酮处理1～4 d，以台盼兰染色，计数活细胞，绘制生长曲线。 　　1.2.4 细胞增殖的检测 取对数生长期的结肠癌细胞株HT29，按传代方式制成单细胞悬液，活细胞计数大于98%，细胞密度为5×104/ml。将上述细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200 μl(相当于1×104个细胞)，另取一孔加入不含细胞的培养液作为空白调零。将培养板置在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养24 h后，各孔中加入三羟异黄酮(0、10、30、90 μmol/L)，即对照组、低、中、高浓度组，共4组，每组3复孔。此后每天更换培养基及加药使其保持药物浓度，且每天行MTT法检测细胞增殖情况。 　　1.2.5 检测细胞周期和细胞凋亡的变化 取生长状态良好的结肠癌细胞株HT29，0.25%胰酶消化制成细胞悬液，按传代方法接种于75 ml培养瓶，每瓶细胞数相等，加培养液至5 ml/瓶，设实验组和对照组。实验组分低、中、高浓度梯度。每个浓度及对照组各3瓶。培养24 h后，实验组加入三羟异黄酮母液使其终浓度分别为10、30、90 μmol/L。对照组不加药，继续置37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养，每天更换培养基及加药使其保持药物浓度，加药3 d后，用0.25%的胰酶消化后制成单细胞悬液，800～1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤1次，然后细胞重悬于PBS中，调密度为1×106/ml，用400目筛网过滤2次，70%乙醇固定，4℃保存，按PI一步法染色后上机检测。 　　1.2.6 检测ERβ的表达 将细胞悬液以3×104/孔接种于预先处理的玻片的24孔板上，继续培养24 h，加入不同浓度的三羟异黄酮，培养72 h，取出玻片，以0.01 mol/L PBS洗后95%的乙醇固定30 min，-20℃冰箱保存备用。常规SP法免疫细胞化学法检测ERβ的表达，即细胞玻片用0.01 mol/L PBS洗后，在