STAT3SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖及凋亡.doc

STAT3SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖及凋亡 　【摘要】 目的: 观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡中的作用. 方法: 不同浓度的槲皮素及阳性对照组(AG490 40 μmol/L)作用细胞后,MTT法检测细胞毒作用;流式细胞术检测细胞凋亡;Real time RTPCR, Western Blotting检测stat3，survivin基因mRNA及蛋白的表达. 结果: 随作用时间延长和浓度增高，槲皮素对SGC7901细胞增殖的抑制作用增强. 48 h槲皮素40 μmol/L组与阳性对照组凋亡率相近. Stat3，survivin mRNA之间呈直线相关关系(r=0.697，P=0.002)，且pstat3和survivin蛋白也呈直线相关关系(r=0.748，P=0.003). 结论: 槲皮素可能通过调控STAT3SURVIVIN途径抑制胃癌SGC7901细胞增殖并诱导凋亡. 【关键词】 stat3基因 survivin基因 槲皮素 胃肿瘤 细胞增殖 细胞凋亡 信号转导通路 　　0引言 　　槲皮素(quercetin, Que, 3, 3′, 4′, 5′, 72五羟基黄酮)又称槲皮酮,为中药槲树皮的主要提取成分,具有广泛的药理活性，如抗炎、抗肿瘤等. Stat3，survivin是继bcl2之后相继发现的两个重要的凋亡抑制基因. 大量体内外研究表明抑制这两种基因的表达或功能可以抑制肿瘤细胞生长,促进凋亡［1-2］. 黄酮类抗肿瘤药槲皮素是否通过抑制STAT3SURVIVIN途径促使肿瘤细胞调亡，目前尚属未知. 我们施用槲皮素于胃癌SGC7901细胞,观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡中的作用. 　　1材料和方法 　　1.1材料人中分化胃癌细胞株SGC7901,由兰州大学分子生物学教研室提供;干粉型RPMI1640,槲皮素,DMSO,AG490购自Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;MTT购自Inventrogen公司;总RNA柱式提取试剂盒购自BBI公司;Real Time PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司. Stat3上游引物: 5′CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG3′,下游引物: 5′GCACGTACTCCATCGCTGACA3′,扩增产物114 bp；survivin上游引物:5′AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG3′,下游引物: 5′TCATCCTCACTGCGGCTGTC3′,扩增产物127 bp;内参照GAPDH上游引物:5′GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA3′,下游引物:5′GTTACTGT CCCGGATCTTGTCCA3′,扩增产物138 bp,均由宝生物工程（大连）有限公司合成. 兔抗人stat3多克隆抗体购自Cell Signal公司;兔抗人survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司. 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养及MTT法检测细胞毒作用SGC7901细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中培养, 37℃,50 mL/L CO2孵箱中贴壁生长, 2.5 g/L胰酶消化传代. 实验分为空白对照组,阴性对照组（0.5 mL/L DMSO），阳性对照组（AG490 40 μmol/L），槲皮素4个浓度组（20,40，80，160 μmol/L）. 取同一批次对数生长期细胞制成单细胞悬液,5×103/孔接种于96孔板,每组设4个复孔. 24 h细胞贴壁后,弃培养液,加200 μL/孔无血清培养基同步化24 h,再次吸弃培养液,加无血清培养基180 μL/孔及各组药物,使终体积为200 μL/孔,终浓度为所需值. 分别于加药后24,48,72 h测吸光度值A(λ=490 nm). 抑制率计算公式：细胞抑制率(%) =(1-A处理组/A对照组)×100%. 计算IC50值,选择3个浓度进行后续实验. 　　1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素（40 μmol/L）组. 细胞以5×105/mL的浓度接种于50 mL培养瓶，每组3瓶. 处理步骤同上. 加药后48 h胰酶消化，收集细胞,离心（800 r/min，5 min）,弃上清,加PBS液至总体积为1.5 mL/管,上流式细胞仪（双染法）检测细胞凋亡. 　　1.2.3Real Time RTPCR检测stat3和survivin基因mRNA的表达实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素(20,40,80 μmol/L)组. 细胞处理同上. 收集48 h细胞，用EZ Spin Column提取细胞总RNA,