局部注射唑来膦酸及同种异体成骨细胞移植修复股骨头坏死的实验.doc

南方医科大学 博士学位论文局部注射唑来膦酸及同种异体成骨细胞移植修复股骨头坏死的 实验研究 姓名：彭晨 申请学位级别：博士 专业：人体解剖与组织胚胎学 指导教师：原林王志强博士学位论文 局部注射唑来膦酸及同种异体成骨细胞移 植修复股骨头坏死的实验研究 博士研究生：彭晨 指导教师：原林王志强 摘要背景与目的： 股骨头缺血性坏死（Ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｍｏｒａｌ Ｈｅａｄ，ＯＮＦＨ）是一种慢性进行性致残性疾病，如果不治疗，超过７０％的病人在诊断后３＿４年将不得不行假体置换术，由于其发病人群以３０．５０岁中青年为主，许多患者一生中不得不面对多次的关节置换，无论是精神上，还是经济上都是沉重的负担。早期治疗对防止患者致残和预后至关重要，保存自体股骨头，防止塌陷是治疗的主要目标。股骨头坏死塌陷的进展与修复反应密切相关，特别是坏死区骨吸收作用。坏死骨仍保留负重能力，但修复过程启动、再血管化和重建开始后却出现骨结构损害和力学性能降低。从本质上看，不是骨细胞的死亡引起承重区塌陷，而是随着再血管化的开始，破骨细胞对坏死骨的吸收造成结构的破坏。再血管化过程中，破骨细胞活动过度，成骨细胞能力不足，骨吸收与骨生成之间不平衡，机械性能降低，在坏死骨与活骨之间产生应力集中，最终发生塌陷。如果能延缓或者抑制坏死骨吸收直到有足够新骨形成，可以保持股骨头骨结构，缓解甚至阻止塌陷的发生。 双膦酸盐是作用很强的破骨细胞活性抑制剂，近几年应用双磷酸盐治疗股骨头坏死的研究逐渐开展并引起关注，其应用的生物学基础是以破骨细胞性骨吸收作用为特征的修复反应与股骨头变形发展之间的关系。研究发现在组织学水平，双膦酸盐可降低骨重建率，收缩骨重建范围，所保留的骨组织矿化增多，骨密度增高，保持骨结构，更好的对抗负重。 中文摘要 但是，应用双膦酸盐类药物治疗股骨头坏死仍有很多问题尚未解决：双膦酸盐对破骨细胞的影响及作用已得到大家的共识，但其对成骨细胞的作用还存在争议，不同种类、浓度的双膦酸盐影响不同；目前的给药剂量大多参考骨质疏松的治疗剂量，尚不知治疗股骨头坏死的最适剂量；双磷酸盐的给药途径为口服或系统性用药（静脉内或皮下注射），口服用药吸收性差，存在消化道并发症，系统性给药可能造成。肾脏损害。另外，系统性用药的生物药效率研究表明，只有当坏死局部的血液循环恢复药物才会输送到达，为了取得较好的药效，动物实验中不得不给予较高的剂量，易导致成人骨软化和儿童长骨生长抑制。 股骨头坏死是股骨头局部缺血导致的局部坏死，有必要去研究股骨头骨内局部应用双膦酸盐阻止股骨头变形塌陷的治疗潜力，局部用药剂量小，不必考虑血运情况，可避免前述并发症。本研究应用第三代双磷酸盐一唑来膦酸，从唑来膦酸对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性、矿化和骨钙素 （ＯＣＮ）、骨保护素（ＯＰＧ）／骨保护素配体（ＯＰＧＬ）ｍＲＮＡ表达的影响入手，探讨唑来膦酸对骨形成的影响和局部应用的可行性；制备大鼠股骨头创伤性坏死的模型并观察其病理形态变化，验证造模成功，探讨股骨头坏死的病理演进过程及机制；在髓芯减压术基础上，不同剂量唑来膦酸坏死区局部直接用药治疗，复合成骨细胞的同种异体移植，提高坏死局部成骨能力，以期望获得阻止骨破坏和增加新骨生成，缓解甚至阻止股骨头塌陷的目的。方法： １、唑来膦酸对体外培养的大鼠成骨细胞功能的影响： 新生２４ｄ，时内ＳＤ大鼠，酶消化法无菌条件下分离大鼠颅盖骨成骨细胞，沉淀的细胞中加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，吹打成细胞悬液植于培养瓶中，在５％Ｃ０２、３７”１２饱和湿度条件下培养箱中培养。细胞２４ｄ，时后贴壁，４８ｄ＊时换液一次，之后培养液每３天更换１次。细胞长满至８０％后传代，应用第三代成骨细胞实验。细胞增殖检测（四甲基偶氮唑盐比色法，ＭＴｒ法）：按照培养基中唑来膦酸终浓度分为实验组：唑来膦酸浓度１０４Ｍ—ｌ００１Ｍ，对照组：不加药，只加等量培养基。细胞经胰酶消化后ＰＢＳ清洗，收集细胞，调整细胞悬液密度为７ｘ１０３个／孔种：Ｊ：９６孔板，每孔加培养基２００ｕｌ，每组８个复孔，共５板，２４ｄ，时贴壁 ｎ 博士学位论文后换含药培养基，对照组更换普通培养基，每３天更换一次培养基。分别于培养ｌ、２、３、５、７天取１板行ＭＴＴ检测，每孔加／入２０ｐｌＭＴｒ（５ｍｇ／ｍ１），３７℃继续孵育４ｄ’时后终止培养，吸弃孔内培养液，每孔加入１５００ＩＤＭＳＯ（－－甲基亚砜），振荡１０分钟，在酶标仪上测定各孔光吸收值，波长４９０ｒｉｍ，取其均值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制出生长曲线，反映出不同组的细胞增殖状况。碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性检测：按照含唑来膦酸浓度分为实验组：１００ Ｍ，１０母Ｍ，１０‘１１ Ｍ及对照组４组，每３天更换含药培养基，对照组换普通培养基，培养５天后，胰