大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定.doc

大豆根瘤菌的筛选及分子鉴定 韩孝强 （天津农学院 农学系） 1 前言 根瘤菌是可以与豆科植物共生形成根瘤，将空气中的氮还原成氨，提供植物营养并能促使植物异常增生的一类革兰氏阴性菌。如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，称为类菌体[]。常制成细菌制剂在田间施用，作为作物或牧草增产的一种手段。 [4]。 众所周知，大豆是富含蛋白质的一种作物，构成蛋白质的主要元素就是氮，而空气有80%都是由氮气组成的，根瘤菌正是利用了这种最廉价的原料来满足了大豆生长过程中氮元素的需要 [5]。 而且根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题[6]。因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标[7]。 传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定[8]。但近几十年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中己得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定[9]。 细菌含有3种不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA。它们分别行使着不同的功能，其中rRNA可将遗传信息得以表达，转译成蛋白质，它在所有细菌中都有一定的碱基序列和空间结构。不同种类的细菌，rRNA在不同位点上的序列改变频率也不同。因此，这些分子可作为种系标记物用以鉴别不同的细菌。原核生物的核糖体由50S和30S两个亚基组成，而30S亚基又包含3种类型的rRNA，即23S、16S和5S rRNA，它们分别含有约2900、1500和120个核苷酸。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析也较困难[10]。16S rRNA为核糖体小亚基中的的RNA，而16S rDNA为编码该亚基RNA的基因。从上世纪70年代以来，科学家们因16S rRNA的保守性，对其进行了大量研究工作，现在已对16S rDNA序列有了清晰的认识[11]。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因,长度约为1500 bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相间的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，是生物的种属鉴定和系统发育的重要分子基础。目前，rRNA分子己经成为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，加上大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。从而精确地揭示了微生物种类和遗传特征的多样性[12]。 近几年来，我国的微生物肥料生产发展较快，但在生产应用中反映出一些问题，如有的菌种质量不好，肥效不高，微生物肥料的品种也不多[13]。发展微生物肥料，重要的一个方向是要应用现代生物技术筛选出高效、抗逆、强竞争存活能力的菌株，以适应微生物肥料发展的需要[14]。 本文先从未喷洒，喷洒国产和喷洒加拿大菌剂后的三种大豆根的根瘤中分离出革兰氏阴性菌株，再利用16S rDNA分子鉴定筛选出慢生型大豆根瘤菌，与原菌剂中的菌株比较同源性，验证该菌株是原菌剂中的根瘤菌，从而证明该菌株可以引起大豆根结瘤。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 大豆根 大豆根1：未喷洒任何根瘤菌剂所生长的大豆根。大豆根2：喷洒国产根瘤菌剂所生长的大豆根。大豆根3：喷洒加拿大根瘤菌剂所生长的大豆根。三种大豆根均来自黑龙江九三试验田。 2.1.2 培养基 YEM培养基：甘露醇10 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，酵母粉0.4 g，蒸馏水1 L，pH 6.8，121 ℃灭菌30 min。 2.1.3 主要试剂 2.1.3.1 主要试剂盒 细菌基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，试剂盒组成为：Buffer GTL，Buffer GL，Buffer GW1，Buffer GW2，Buffer GE。 2.1.3.2 主要试剂及其配制 结晶紫染液：结晶紫1 g，95%乙醇20 mL，1%草酸铵水溶液80 m