一种新型凋亡素融合蛋白克隆表达及活性测定.doc

一种新型凋亡素融合蛋白克隆表达及活性测定摘要：目的克隆表达EC?SOD3?凋亡素融合蛋白，并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列，与表达载体EC?SOD3?pET?28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导，表达产物进行Ni2+?NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET?28a?EC?SOD3?apoptin经酶切鉴定和序列分析，证明质粒构建正确，转化E.coliBL21(DE3)后，重组蛋白获得表达，Ni2+?NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85％以上，经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET?28a?EC?SOD3?apoptin，并在大肠杆菌中表达了EC?SOD3?凋亡素融合蛋白，纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。 关键词：EC?SOD3?凋亡蛋白；克隆表达；纯化；噻唑蓝法 中图分类号：Q591.2文献标识码：A文章编号： 1672?979X(2009)07?0007?05 凋亡素(apoptin/VP3)能特异性的诱导动物和人体肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响[1?3]，并且凋亡蛋白选择性诱导肿瘤细胞凋亡是非p53依赖途径[4，5]，这一特性有希望将凋亡蛋白开发成新一代治疗肿瘤的药物。目前开发重组凋亡素蛋白药物主要有两条途径：一是构建以反转录病毒为主要骨架的真核表达载体，通过转染方式感染受体细胞，使克隆的凋亡素基因在肿瘤细胞中表达，起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用[6，7]；另一途径是在体外用日臻成熟的各种表达系统直接表达重组凋亡素蛋白，分离纯化后直接导入体内发挥作用。前者主要问题是表达载体不稳定性以及病毒基因进入人体后的安全性。后者虽可大量获取目标蛋白并用于体内，但进入体内的药物需逾越细胞膜屏障。 凋亡素蛋白分子本身不能跨膜，如何进入细胞内核定位，发挥诱导凋亡效应引起了学者们的广泛关注。目前已发现10多种小肽携带外源蛋白等具有跨膜转运作用[8?10]。分析已知的跨膜肽一级结构，表明均富含Arg、Lys类碱性氨基酸，分布着很强的正电荷，来源于人的胞外SOD(EC?SOD3)羧基末端(210～222位氨基酸)的一段小肽具有肝素靶向特性[11]。我们通过分析胞外SOD(EC?SOD3)，发现其羧基末端肝素结合域(HBD)具有典型的跨膜肽特征，推测HBD可能具有跨膜转运作用。我们利用EC?SOD3羧基末端的小肽与凋亡蛋白融合表达，观察apoptin?EC?SOD3是否具有抑制肿瘤细胞生长的能力，这对凋亡蛋白抗肿瘤活性的研究具有积极意义。 1材料 含有凋亡蛋白全长基因的质粒pET?11a?vp3(浙江日升昌药业公司提供)；质粒pET?28a、EC?SOD3?pET?28a(简称C?pET28a)和菌株BL21(DE3)、HeLa细胞等(本实验室保存)；低相对分子质量蛋白质标准和DNAMarker(上海生工)；PCR产物克隆用载体pMD?18T、限制性内切酶、Taq酶质粒小量抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(Takara)；硫酸卡那霉素(Amreseo分装，Genebase)；IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Genebase)；其他化学试剂为国产分析纯；引物合成和DNA测序由上海生工公司承担。 2方法 2.1大肠杆菌的培养 大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)的培养、质粒提取、酶切、连接、转化、SDS?PAGE电泳等按文献[12]操作。 2.2引物设计与PCR扩增 根据GenBank报道的凋亡素编码序列(GenBank登录号：AY171617)设计PCR引物。引物1：5?GA[ZZ(Z]CATATG[ZZ)]ATGAACGCTCTCCAAGAAGA?3’，含NdeI限制性酶切位点；引物2：5?TG[ZZ(Z]GGATCC[ZZ)]TTACAGTCTTATACGCCTTTTTG?3’，含BamHI限制性酶切位点。PCR反应体系溶液组成为2μL10×Taq缓冲液，0.5μLdNTP(10mmol/L)，0.5μL引物1(10μmol/L)，0.5μL引物2(10μmol/L)，1μLpET?11a?vp3，0.2μLExTaq酶，ddH2O补足至20μL。PCR反应条件：97℃预变性5min进入循环，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，然后72℃延伸10min。 2.3原核表达与鉴定 将含有重组质粒pET?28a?EC?SOD3?apoptin的BL21(DE3)菌株接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12h后按2％接种量接种于二级瓶，当菌密度A600nm达0.4～0.6时，加入1mmol/LIPTG诱导培养6h，离心收集菌体，超声破壁后产物进行SD