二梯度离心试验原理-黑龙江生物科技职业学院.PPT

第二章 细胞破碎与固液初级分离技术 学习重点 常用的细胞破碎方法 发酵液预处理技术 离心分离方法及应用 粗滤分离方法及应用 第一节 细胞破碎技术 一、破碎方法 机械破碎法 非机械破碎法 二、选择破碎方法的依据 细胞的处理量 细胞壁的强度和结构 目标产物对破碎条件的敏感性 破碎程度 第二节 固—液初级分离技术 一、发酵液的预处理 发酵液过滤特性的改变 杂质的去除 杂蛋白的去除1、沉淀法：主要针对蛋白质。2、吸附法：加入吸附剂或沉淀剂。3、变性法：常用方法有加热、大幅度调pH值、加有机溶剂或表面活性剂。 二、固液初级分离的方法与应用 离心分离 粗滤分离 泡沫分离 离心分离 离心分离设备 离心分离方法及其应用 大容量冷冻离心机 离心分离设备 离心分离方法及其应用 差速离心法 密度梯度离心法 等密度离心法 粗滤分离 粗滤分离设备 粗滤分离方法及应用 板框压滤机 泡沫分离 泡沫分离的原理 泡沫分离的应用 机械破碎法 捣碎法 珠磨法 高压匀浆法 超声波破碎法 非机械破碎法 冻结--融化法 渗透压冲击法 有机溶剂法 酸碱法 酶溶法 发酵液过滤特性的改变 降低液体粘度 调整pH 凝聚和絮凝 加入助滤剂 加入反应剂 杂质的去除 高价无机离子的去除 杂蛋白的去除 差速离心法：在不同离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。一般用于分离沉降系数相差较大的粒子，如常用于细胞匀浆中细胞器的分离 。 密度梯度离心法 仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。因此大小相同，密度不同的粒子(如线粒体、溶酶体和过氧物酶体)不能用此法分离 等密度离心法 等密度离心的有效分离仅取决于粒子的密度差，与粒子的大小和形状无关，但是此二者决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 实验一 细胞破碎及梯度离心(一) 细 胞 破 碎 目的要求 原理 材料用具 酶 抽 提 物 的 制 备 1、拿一块土豆，洗去上面的泥土。 2、去土豆皮后切成小块 3、称取50g土豆块放入匀浆器中，再加入氟化钠溶液50ml。 4、在匀浆器中研磨30s。 5、把匀浆物通过几层细布滤入一个100ml的烧杯中。 6、加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min。 7、在4000r/min下离心15min，倒掉上清液。 8、将沉淀物用大约15ml柠檬酸缓冲液溶解，即得该酶粗制品 酚 氧 化 酶 的 颜 色 反 应 将3只干净的试管编号为1、2、3。 试管1：加入15滴酶抽提液和15滴.01mol/L的 邻苯二酚溶液 试管2：加入15滴酶抽提液和15滴水 试管3 ：加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液和15滴水 把3只试管放于37℃水浴中。每隔5min震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化，共反应25min。观察现象 (二) 梯 度 离 心 目的要求 原理 材料用具 制 备 蔗 糖 溶 液 （一）梯度液的制备： 先制备出蔗糖不同浓度的溶液，浓度间隔相同（20%，40%，60%，80%），然后每个浓度取相同容量，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度。此离心管于20-25℃静置2--3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5～1h。温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。 制 备 蔗 糖 溶 液 （二）密度梯度离心： 向已成密度梯度的离心管中加入半滴墨汁，放入离心管中离心，3000r/min下离心10min。观察现象。 思考 题 溶液的密度自上而下逐渐变化的分布状态称为密度梯度。 在超速离心技术中，样品的密度应分布在溶液的密度梯度 范围内。 蔗糖 20%，40%，60%，80%蔗糖溶液 烧杯、普通离心机、试管若干。 操作方法 操作方法 * 黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术 生物分离技术 主讲人：张爱华 实验原理 2 材料用具 3 操作方法 4 目的要求 2 1 5 熟悉细胞破碎的基本方法 熟练掌握机械破碎法操作技术 机械破碎法：①捣碎法；②珠磨法； ③高压匀浆法；④超声波破碎法； 非机械破碎法：①冻结-融化法；②渗透压冲击法； ③有机溶剂法；④表面活性剂法； ⑤酸碱法；⑥酶溶法。 土豆 0.1mol/L的NaF溶液（将4.2g氟化钠溶于1000ml水中） 0.01mol/L的邻苯二酚溶液 （将1.1g邻苯二酚溶解于1000ml水中， 用稀氢氧化钠调节溶液的pH值为6.0）。