第一章 细胞的分离与胞内.ppt

第一章 细胞的分离与胞内产物的溶解 第一节 细胞分离(重点） 第二节 细胞破碎 第三节 包涵体的分离和蛋白质的复性 第一节 细胞分离 细胞分离的主要技术手段 一、重力沉降 二、离心沉降 三、过滤 一、重力沉降 概念：指因组成悬浮系的流体和悬浮物具有密度差，在重力场中发生相对运动，因而得到分离的沉降操作。 菌体和动植物细胞的重力沉降特点：简便易行；但菌体细胞体积很小，沉降速度很慢。 因此需使菌体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后再进行沉降操作，提高沉降速度。 措施：加入中性盐、聚丙烯酰胺等高分子絮凝剂 固体颗粒匀速沉降时的沉降速度为 dp2（ρS－ρL）g vg＝ 18μL 其中：dp为固体颗粒粒径； ρS为固体密度； ρL为液体密度； g为重力加速度，9.81； μL为液体粘度 二、离心沉降 （一）离心分离原理 （二）离心分离方法 （三）离心分离设备 （一）离心分离原理 离心沉降是在离心力的作用下发生的 单位质量的物质所受到的离心力： 式中： r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距离； ω为旋转角速度； N为离心机的转数，s－1 分离因子Z定义： 离心设备所能达到的离心力/重力加速度(g)的比值 意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数， 用于离心机的分类 固体颗粒离心沉降速度： 式中：dp为固体颗粒粒径 ρs为固体密度 ρL为液体密度 μL为液体粘度 Vs还可用下式表示： 其中S称为沉降系数 （二）离心分离方法 （1）差速离心分级 （2）区带离心 （1）差速离心分级 差速离心是生化工业中最常用的离心分离方法 如以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离；菌体和细胞一般在500-5000g的离心力下就可完全沉降；工业规模的离心操作中，为提高分离速度，所用离心力较大。 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 （2）区带离心 用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。 方法：事先在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖、CsCl、NaBr溶液）调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心操作。 分为：差速区带离心、平衡区带离心 差速区带离心 差速区带离心的密度梯度中的最大密度小于待分离的目标产物的密度。 离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降的越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。 平衡区带离心 平衡区带离心的密度梯度比差速区带离心的密度梯度高，离心操作的结果使料液中的高分子溶质在与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带，区带中的溶质浓度以该密度为中心，呈Gauss分布。 （三）离心分离设备 按设备所能达到的离心力或离心转数分类： 低速离心机、高速离心机、超速离心机 按用途分类： 1)分析性：一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和分子量等。 分析性离心机都是超速离心机。 2)制备性：主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大 。实验室用；工业用 按工业应用分类: 1) 管式离心机 2) 碟片式离心机 管式离心机 又称圆筒式离心机，结构较简单 操作时，料液从圆管下端的中心输入，在离心力作用下，管内液体基本上是以旋转轴为中心的圆筒面，从上端的中心排出轻相（上清液）。 间隙操作时，固体颗粒沉降于管壁；连续操作时，从管壁附近的出口排出重相（浓缩的悬浮液） 应用：液-液分离(连续式)； 低固体含量(1%)的固-液分离(间歇式) 优点：结构简单，价廉； 分离效果好，分离因子高（8000－15000g） 缺点：沉降面积小，处理能力有限； 低固体含量的悬浮