第8章 标记.ppt

第八章 标 记Methods of Labelling 概念 标记：以共价键的方式将某些元素或化学基团（标记物）结合到生物分子中，成为示踪复合物（探针），通过一定的方法显示其存在的部位。 探针：带有标记物的、感兴趣的生物大分子或小分子，当它们与相应的物质反应时（杂交），筛选得到确定的信息资料。 标记物：放射性同位素、化学发光物、生色基团、荧光物等。 内容提要 第一节 核酸标记 第二节 蛋白质（酶、抗体）标记 第一节 核酸标记（制备探针） 核酸探针（probe）：能与特定核酸序列（靶序列）发生特异性互补（核酸）杂交，并含示踪物的已知核酸片段(DNA或RNA)。因而可检测样品中特定的基因序列。 探针所携带的标记物应具备的条件： 1.标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 2.标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 3.稳定性好、环境污染少、价廉。 一、标记物的制备及类型 以标记物分类： 放射性同位素标记（3H,14C,32P,35S,125I） 非放射性同位素标记（地高辛、生物素、酶、荧光素） 以制备方法分类： 双链DNA探针标记法； 单链DNA探针标记法； PCR合成DNA探针； 寡聚核苷酸探针； RNA探针。 标记方法 掺入法:即在DNA、RNA合成时，标记物携带在单核苷酸上，作为合成的原料形式直接掺入进去。 方法分类： 1.随机引物法 2.切口平移法 3.cDNA合成法 4.PCR法 5.3’，5’末端寡聚核苷酸 6.3’加poly(A)尾等方法。 二 、非核素标记 非放射性核素标记都很容易掺入到DNA或RNA中制成核酸探针。 使用的非放射性物质主要是生物素、地高辛、荧光素。 检测方法主要有三种：化学发光法、生色法、荧光法。 DIG标记是德国Boehringer Mannheim公司发展的一种非放射性标记方法。Digoxigenin-11dUTP可以通过随机引物标记结合到DNA探针或通过DNA体外转录标记到RNA探针，或通过3′-尾端标记结合到寡聚核苷酸探针。然后与抗地高辛抗体（anti-digoxigenin alkaline phosphatase）进行免疫反应，通过化学呈色检测。 技术特点： 与放射性标记相比较，DIG 系统具有以下多个优势： ?高灵敏度 ?曝光时间短 ?安全环保 ?探针可重复使用 ?可轻松进行探针拨离和重探 三、核素标记 （一）核酸探针传统的标记物是用放射性同位素，多用32P dNTP、3H dNTP 、35S dNTP等。用放射性同位素标记核酸有以下优点： 1.灵敏性高 2.特异性高 3.方法简便 （二）放射性同位素标记技术也存在以下缺点： 1.半衰期短，必须经常标记探针 2.费用高 3.检测时间长 4.放射性同位素对人体有害 1.32P 2.33P比32P使用安全。 3.含35S的前体标记物NTP或dNTP是借助以取代与磷酸共价相连的氧原子制成的。 4.3H标记的探针常用于原位杂交和核酸的合成和降解分析，与32P、35S、125I等比较，它的能量最低。 32P or 33P 可取代dNTP或NTP不同磷酸位上的P原子 ，35S可取代核酸中磷酸分子上的一个O原子，3H取代H原子。 四、常用的探针标记法 1.双链DNA探针标记 （1）随机引物介导法 （2）切口平移法 2.单链DNA探针制备 3.PCR合成DNA探针 4.寡核苷酸探针的制备 5.RNA探针的制备 1.双链DNA探针标记（1）随机引物介导法 随机引物是6～12个核苷酸单链（来源于某种生物组织细胞的DNA降解小片段或人工合成的）。 随机引物与线性DNA模板杂交，在DNA聚合酶的催化下，从引物的3′末端开始按5′→3′方向合成与模板DNA互补的DNA链，如有[α-32P]dNTP或其他标记物的掺入，就可产生标记的DNA探针。见P182图 变性DNA 加入随机引物混合物 (六核苷酸)和dNTP标记混合物 加入Klenow 片断 (无核酸外切酶活性) （2）切口平移法（Nick Translation） 原理及过程： 当双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶I可把核苷酸残基加到切口处的3’ 羟基端。由于该酶具有5’ → 3’外切核酸酶活性，所以它可从切口的5’端除去核苷酸。5’端除去与3’端加入核苷酸同时进行，导致切口沿着DNA模板链移动。随着反应的进行，底物中被标记的单核苷酸被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 2.单链DNA探针制备 用DNA模板制备单链DNA探针的方法有： （1）合成可克隆于噬菌粒或M13