活体细胞溶酶体膜通透性（LMP）完整性吖啶橙荧光检测试.doc

活体细胞溶酶体膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙荧光检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 溶酶体膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙荧光检测试剂是一种旨在通过技术，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，存在于或由释放到细胞浆的荧光染料，来分析和观察膜通性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞（动物、人体、昆虫等）膜通性的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。 技术背景 例如朊病毒脑病（prion encephalopathies）、病内容物释放到胞浆中吖啶橙 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 染色液（Reagent B） 微升产品说明书 1份 保存方式 保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月 用户自备 24孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器 1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器 微型台式离心机：用于沉淀细胞 培养箱：用于染色孵育 （共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析 荧光分光光度仪或酶标仪：用于细胞荧光定量分析 细胞流式仪：用于细胞荧光分析 实验步骤 贴壁细胞染色 准备1个细胞培养24孔板的待测细胞（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项8） 小心抽去细胞培养液 小心沿着孔壁加入微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面 小心抽去清理液 小心沿着孔壁加入微升 染色液（Reagent B）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面 放进37℃细胞培养箱里孵育分钟，避免光照 小心抽去 染色液（Reagent B） 小心沿着孔壁加入微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到细胞培养孔 小心抽去清理液 重复实验步骤8和9一次 小心沿着孔壁加入微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到细胞培养孔 选择下列方式之一进行操作： （A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）： 激发波长4nm，散发波长5nm――绿色荧光，表明膜通性（）增强激发波长nm，散发波长nm――红色荧光，表明膜通性（）增强 使用荧光酶标仪检测（定量检测）： 激发波长4nm，散发波长5nm――RFU升高，表明膜通性（）增强激发波长nm，散发波长nm――RFU降低，表明膜通性（）增强 悬浮细胞或脱离细胞染色 将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 106细胞）移入到1.5毫升离心管 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 小心抽去上清液 加入微升37℃预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 小心抽去上清液加入微升37预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 加入微升含有 染色液（Reagent B），充分混匀 放进37℃细胞培养箱里孵育分钟，避免光照 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 小心抽去上清液 加入微升37℃预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 小心抽去上清液 重复实验步骤1至1一次 加入微升37℃预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 选择下列方式之一进行操作： 进行细胞流式仪分析：波长488nm，波长nm，散发波长617nm）观察0000个细胞以上―― 波峰移，表明膜通性（）增强 波峰左移，表明膜通性（）增强或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）： 1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片激发波长4nm，散发波长5nm――绿色荧光，表明膜通性（）增强激发波长nm，散发波长nm――红色荧光，表明膜通性（）增强 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）： 1）移取500微升上述细胞悬液到1毫升比色杯2）加入微升 清理液（Reagent A） 3）上下倾倒混匀数次 4）放进荧光分光光度仪：激发波长4nm，散发波长5nm――RFU升高，表明膜通性（）增强激发波长nm，散发波长nm――RFU降低，表明膜通性（）增强 注意事项 本产品为20次（0.5毫升体系/次）操作 操作时，须戴手套 操作时，避免污染母液 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析 孵育时，必须避免光照 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液： 操作容器 建议操作体系 载玻片 100微升 载玻片