有机溶剂中酶催化活性研究进展.ppt

有机溶剂中酶催化活性研究进展 LOGO 1984年，Klibanov提出:只要条件合适，酶在非生物体系的有机溶剂中同样具有催化功能。 目录 有机溶剂中酶催化反应的优势 有机溶剂中酶催化反应的优势 高度的底物选择性 绝大多数有机化合物在非水系统内溶解度很高 根据热力学原理，一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统内进行 有机溶剂可促使热力学平衡向合成方向（如酯合成、肽合成等）移动，如蛋白水解酶在水中催化肽键水解，而在有机溶剂中则催化肽键合成 在有机溶剂中，所有有水参与的副反应（如酸酐水解）将受到抑制 有机溶剂中酶催化反应的优势 在有机溶剂中酶的热稳定性显著提高，可通过提高温度加速催化反应进行 从非水系统内回收反应产物比水中容易 在非水系统内酶很容易回收和反复使用 在有机溶剂中不易发生微生物污染 低水环境可用于稳定具有未知催化性质的构象异构体 低水环境可用于稳定在水中寿命极短的酶反应中间体 影响有机溶剂中酶催化活性的因素 必需水 有机溶剂 酶 缓冲液 盐效应 配体、冷冻干燥剂、赋形剂 超声辐射、抑制剂 必需水 目的：有机相酶催化必需微量的水维持酶活性结构（氢键、疏水键、静电作用、范德华力） 含水量表示方法：百分水含量--热力学水活度aw 原因：水解平衡时，各相的aw值相等；体系的改变伴随着水活度的变化，故从aw值可以推断酶的活性 水模拟物：对水比较敏感的有机相酶促反应 （如:肽的合成）:甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃 有机溶剂 影响酶活原因： 有机溶剂影响酶反应过程中底物和产物扩散，从而间接地影响酶活性 有机溶剂“剥夺”酶分子表面必需水导致酶活力下降 有机溶剂直接与酶作用，通过破坏酶蛋白活性构型的氢键、疏水键作用等，抑制酶活性或使酶失活 有机溶剂 酶活的评价： 溶剂疏水性参数LogP值：溶剂logP越高，其抑制酶活作用越强；溶剂的疏水性增加，酶热稳定性降低（添加剂--所使用的溶剂logP） 酶的相对反应速率与溶剂LogP之间并不呈现线性关系 分配系数(P)：产物分配系数(Pp)与底物分配系数(Ps)比率(Pp/Ps)与酶相对反应速率之间有良好的线性关系（一定条件下）--描述酶在有机介质中活性是十分有效 有机溶剂变性强度参数变性量(DC) 单一参数无法全面表征酶活性的变化，因此，在选择有机相酶催化的有机溶剂必须从不同方面来考虑。 酶 形式：酶粉、化学修饰酶和固定化酶 化学修饰：化学修饰酶由于改变了理化性质，故对酶活性有很大的影响：用糖脂修饰的SOD在有机溶剂中的酶活性甚至比水中还高 固定化酶：酶稳定性增加；底物在载体与有机介质中分配；疏水性底物在载体周围浓度较低；载体影响物质传递 缓冲液 酶冷冻干燥时的缓冲液对有机相酶催化活性有极重要的影响，缓冲液有四个重要因子:pH、缓冲液类型、缓冲液的量、水的浓度 有机溶剂中的酶有些能够“记忆”它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH，这种现象为“pH记忆” （1）酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的pH密切相关 （2）反应的最适pH接近于水溶液中的最适pH 缓冲液 缓冲溶液种类：由于缓冲液对酶表面微弱的物理效应；不同的缓冲液在结晶和冷冻干燥过程中，冰冻水溶液的相行为的差异；缓冲液与残余水之间相互作用的不同；不同缓冲液与酶或底物间存在相互作用。 由于酶离子化基团质子化状态与酶活性关系密切，因此可采用适当的有机相缓冲液控制低水介质中酶离子化状态，进而影响酶活性。如：氨基酸-氨基酸氯盐对(如Lys and Lys.HCI)固态缓冲液的研究表明合适的结晶固体能控制有机介质中酸-碱条件。 盐效应 研究现象：酶活性随着KCI浓度升高而急剧上升 盐诱导酶活性机理被认为有两个重要因素 盐保护酶免受有机溶剂毒害 在冷冻干燥过程中，盐可以保持酶的天然构型 盐效应 Y.L.Khmelnitsky：盐基质对有机溶剂致使酶失活提供一种保护效应【当盐浓度较低时，冷冻干燥蛋白酶构成的固体催化颗粒具有疏松结构;当盐浓度较高时，催化颗粒象盐晶体一样，具有刚性结构，对酶起保护作用】 Michael ：盐诱导催化活性是由于冷冻干燥时间与酶水含量而决定的【酶活性随冷冻干燥时间增加而增加，水含量低于最适含量，则迅速降低】 显然不同的催化效率是基于盐的结合与冷冻干燥过程双重结果。可见，盐效应机制有待进一步研究 配体、冷冻干燥剂、赋形剂 酶在冻干前可用配体、冷冻干燥剂为酶作印迹，使酶以一种高活性构象形式而经冻干在有机介质中得以保持，这种现象称之为“分子印迹” 冷冻干燥剂：山梨醇、木糖醇、海藻糖、甘露醇 赋形剂与酶冷冻干燥后也极大地提高酶活性，但直接向有机溶剂中加赋形剂对反应无大的影响 赋形剂激发酶机理：赋形剂能缓解酶在冷冻干燥时失活，赋形剂所激发的酶活性通过用无水有机溶剂洗掉赋形剂后消失，这与配体作用机理有所不同 超声辐射