sybr法实验流程及注意事项.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * rRNA丰度高，占总RNA的80%，研究表达丰度较高的基因时比较适合；rRNA转录调节受其它因素影响，如28s和18s rRNA在有细分裂期间表达量明显减少或停止表达，所以在研究与细胞周期相关的基因时就不适合以此为内参；另外，由于表达量较高，在研究丰度相对较低的基因时，有时就不太适用，比如Multiplex。当然也有rRNA的忠实拥护者，有人认为表达量高才时定量准确的关键，总之各有说法，但选择看家基因最关键的地方还是看该基因在你所研究的体系下是否稳定表达，可通过选择两个看家基因在不同的处理间相互比较，看两者比值是否恒定，如果一致，那么他们都可用作这个实验的看家基因。 * * * * * * * * * * * * 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None 实验数据 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 －1 =10-1/-3.17 －1 =2.03－1 ＝1.03 标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.1726 X + 37.52 QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 X= 20.5-37.52 -3.1726 =5.36 相对定量解析方法 理论上目的基因表达量分析条件 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 相对定量的必要性 以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 相对定量分析——管家基因筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实验值 β-Actin GAPDH β-2-microglobulin HPRT P P P O 双标准曲线法 2 -△△Ct法