浅谈双水相在糖化酶提取中的应用-终改.doc

双水相萃取技术在糖化酶纯化工业中的应用 糖化酶作为发酵行业中将淀粉转化为葡萄糖的重要物质，在酒类、果葡糖浆、有机酸、味精等生产工业中有着不可替代的地位。是最重要的也是我国产量最大的工业酶制剂产品之一[1]。仅在石家庄就有东泉生物制品有限公司、兴达酶制剂有限公司、胜利酶制剂厂等多家糖化酶的生产厂家，但他们在糖化酶的提取纯化中普遍采用硫酸铵盐析法，其只能得到含菌体、盐类、杂蛋白及其他固形物的粗酶液。而且粗品中残余大量硫酸铵，不能满足食品级酶的质量要求。双水相萃取体系的显著优点是传质和分相速度快,原料成本低,所使用有机溶剂无毒或低毒、粘度低、易回收处理、操作简便,同时该体系温和的环境也不会引起生物物质的损伤和破坏。将其用于生物物质的分离和纯化的研究,国内外刚刚起步,但对酶制剂已表现出良好的分离性能。 世界上主要的糖化酶生产厂大约有31家,多分布于英日等国,其中丹麦的NOVO公司被认为是世界最大的糖化酶酶制剂公司。他们采用的是添加无机絮凝剂，如硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶体，以实现双水相分离的方法（也可添加有机高分子絮凝剂，如聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸?、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等）。糖化酶的双水相萃取过程分为三部分:(1)萃取和平衡, (2)上下相的分离(3)多聚物的分离。萃取一般在混和沉降罐中进行。混和沉降罐装有溢流装置, 溢流装置由两相密度差决定,由于体系的表面张力很低, 所以分配能在几分钟达到平衡, 而且界面张力很小, 则界面能低, 搅拌时只需要较小的剪切力就能得到很高的悬浮液, 能耗小。在萃取达到平衡后, 两相一般经过重力沉降或离心分离。离心分离常用的一般是碟片式离心机。离心机完成了相与相的分离后, 要把酶中的多聚物除去。 葡糖糖淀粉酶是我国最大、最重要的酶制剂产品之一。产葡糖淀粉酶的菌株多有报道，如红曲霉、黑曲霉、米根霉等。国外率先使用双水相萃取从技术克服了盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法在分离过程中容易发生蛋白质变性，导致蛋白分离提取的收率和效率相对较低的缺点。Jahnisch等人选用PEG/( NH4)2S04 双水相具有成本低、操作简单、系统粘度小的优点。同时,糖化酶在此双水相系统中分配在下相，减少了下游加工过程的步骤和反萃取的步骤,提高了糖化酶的总收率[2]。Hustedt 以四种不同的淀粉糖化酶发酵液为研究对象，用纯化倍数作为参考指标。在单因素实验基础上，选取四种分子量的聚乙二醇（PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000）、三种盐（MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4）和四种发酵的淀粉糖化酶酶液（米根霉、根霉、酒精酵母、酯化酵母）为自变量。得到他们各自最佳的提取条件[3]。国外最大酶制剂生产厂家诺维信目前已应用双水相技术提取糖化酶。其主要采用PEG(聚乙二醇) 600 /( NH4 ) 2 SO4 两水相系统从全缪液直接萃取糖化酶. 通过对双水相浓度的控制可得到高活性糖化酶。该方法具有糖化酶回收率高,操作安全方便,系统价格低廉,能直接运用于全缪液等优点[4]。 近年来，双水相萃取已经发展成为一种适合于大规模生产、经济简便、快速高效的分离纯化技术，现已被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取，在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化方面更是受到广泛重视。李夏兰[5]等在从粗酶液萃取糖化酶研究的基础上,报道了用PEG /( N H4 ) 2 SO4 两水相系统从未经过滤的全缪液直接萃取糖化酶的研究结果.证明双水相系统纯化糖化酶是可行的.它具有糖化酶回收率高,操作安全方便,系统价格低廉,能直接运用于全缪液等优点.同时,它也为两水相萃取糖化酶等生化大分子物质提供理论基础.杜学敏[6]等人研究了PEG、（NH4）2SO4、NaCl溶液浓度对糖化酶分配系数、回收率以及分相时间的影响，研究表明PEG/（NH4）2SO4双水相提取纯化糖化酶的方法是可行的，通过摸索出的条件：PEG溶液浓度为24%，（NH4）2SO4溶液浓度为20%，其回收率是相当高的，达到了98.81%。而且此方法所用药品价格便宜，操作方便，所用（NH4）2SO4的量远远小于（NH4）2SO4盐析法中（NH4）2SO4的量，大大降低了食品应用的毒性。另外，黄淑霞，吴晓莉，尹卓容用PEG/（NH4）2SO4双水相体系提取、纯化糖化酶，研究了影响体系分配系数、回收率和纯化因子的因素，在其他因素不变的情况下，调整PEG/（NH4）2SO4比例，可以实现酶液从上相到下相的转移。要使酶液分布于下相，通过一系列的实验，从而确定了萃取糖化酶的最佳条件[7]。 双水相研究和应用日新月异，特别是双水相在提取糖化酶上理论、工艺和生产设备不断更新。经过国内外研究