菌种保藏的原理.ppt

　　　　　　　第六章 菌种保藏与种子扩大培养技术 第一节 菌种保藏 一、菌种保藏的原理 通常把生产菌株遗传标记的丢失以及生产能力的下降称为菌种退化，它是菌种自发突变的结果，而生产实践中的培养环境条件不适以及传代次数过多会加快菌种退化的进程。 菌种保藏的基本原理主要是根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般保藏时首先要挑选优良纯种，最好时它们的休眠体（孢子、芽孢等）；其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，即可以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。 二、菌种保藏的方法 1. 斜面保藏法 这是一种短期、过渡的保藏方法，广泛适用于各种微生物的短期保藏。当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为3~6个月，到期后需重新移接新斜面再行保藏。 2. 穿刺保藏法 此法是斜面保藏法的一种改进方法，常用于保藏很多种好气性细菌的保藏。方法是将培养基配制成软琼脂培养基，装入小试管内，高度为1~2cm，经121℃高温灭菌后使其凝固（不制成斜面）。接种时，用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。经培养，微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长，在培养基上覆盖2~3mm的无菌液体石蜡，放入4℃冰箱保存，可保藏6~12个月。 3. 真空冷冻干燥保藏法 由于该保藏方法具有保藏期长、变异小、适用范围广以及便于大量保藏等优点，是目前比较理想的保藏方法，因此，此法为各保藏机构广泛采用。其基本原理是将微生物或孢子冻结，然后在减压情况下使水分升华，使细胞的生长代谢等生命活动处于停止状态，从而得以长期保藏。 4. 液氮保藏法 液氮的温度可达-196℃，远远低于微生物新陈代谢作用停止的温度（-130℃），因此，用液氮能够长期保存菌种，可达9年之久。 5. 低温保藏法 大多数的微生物可在-20℃以下的低温中保藏。 第二节 种子扩大培养目的、流程与影响因素 一、种子扩大培养的目的 种子扩大培养是指将处于休眠状态的保藏菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶、种子罐等逐级扩大培养，从而获得一定数量和质量的纯种的过程。所获得的纯种培养物就称之为种子，作为种子必须具备的条件是：无杂菌污染；生理状态稳定，保持稳定的生产性能；活力旺盛，移接至发酵罐后能够迅速生长；菌体总量能够满足发酵罐所需的接种量。 二、种子扩大培养的流程 1. 种子扩大培养的一般流程 氨基酸生产中，种子扩大培养的一般流程如下（图6-1）： 2. 实验室种子的制备 实验室种子制备阶段包括保藏菌种的活化以及摇瓶培养。 ① 斜面菌种的培养 安瓿管低温保藏的菌种通常要移接到斜面2~3次，经过活化后才应用于生产。一般每次活化时移接一批斜面，其中一部分以斜面形式进行短期保藏，供一段时间（1~2个月）取用。 ② 一级种子的摇瓶培养 在实验室里，采用三角瓶等进行液体恒温振荡培养种子的过程称为摇瓶培养，所得的种子称为一级种子。振荡器有液体恒温控制和气体恒温控制两种，生产中摇瓶数量较多，通常采用气体恒温控制方式进行培养。 3. 生产车间种子的制备 氨基酸发酵生产上，在生产车间以种子罐进行种子培养。种子罐的大小需根据发酵工艺要求和发酵罐容积大小来确定，目前氨基酸生产工艺一般要求接种量为10%左右，故种子罐溶积一般为发酵罐容积的10%左右。如果发酵罐容积极大，而菌种生长又比较缓慢，可考虑采用多级种子罐完成种子的扩大培养。例如，有些工厂的赖氨酸发酵罐为300m3，采用了3m3种子罐和30m3种子罐进行逐级培养，即先把一级种子接入3m3种子罐培养至一定菌体浓度，然后再移接到30m3种子罐，培养成熟后才移接到发酵罐。这一过程通常称为三级种子培养流程，3m3种子罐培养的种子为二级种子，30m3种子罐培养的种子为三级种子。但为了减少染菌机会，对于生长迅速的菌种，如谷氨酸生产菌种，一般采用二级扩大培养流程。种子罐的搅拌转速以及其它结构根据菌种以及工艺的不同而定。 三、影响种子质量的主要因素 1. 培养基 种子培养基以培养菌种为目的，其