荧光蛋白 - 生物化学与分子生物学.ppt

综述与要点 大肠杆菌染色体是一种环状的DNA双链分子，在活细胞中，DNA体积进行1000倍压缩，只在其细胞体积中占15 ％。 基因组（染色体）的管理是有规律性的，这有利于染色体维护和操作。 新技术的发展，如基因位点的标记与分子水平的遗传位点同步跟踪，（也就是说，随时间的推移，这种分子机制能在活细胞内检测出）。 这些研究通过基因定位，对染色体的复制进行可视化，揭示出一个高通量的动态的基因复制和大分子行为。 总结与展望 E.coli 是典型的真细菌代表，原核生物中，迄今为止利用面最广，利用价值最大，如工程菌。 通过E.coli染色体的研究对其他细菌的复制研究具有参考和启示的作用。 在遗传和生物学进化上有价值。 大肠杆菌及其染色体 刘 超2009-05-20 用于 染色体相关的 显微镜成像方法 免疫组织化学方法 荧光分子机制 荧光原位杂交（ FISH ） 荧光阻遏子-启动子系统( FROS ） ParB–parS 系统 免疫化学 这些方法需要固定的细胞因而样品破坏。 此外，抗体相互作用可导致降低效率。 利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量。 荧光蛋白 在活细胞中，利用含有绿色荧光蛋白（ GFP ）融合蛋白，彻底让我们直观地观察和理解细胞组织的功能。 利用不同的荧光蛋白质，就可以在同一时间追踪多种成分的活体细胞。 荧光原位杂交（ FISH ） 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA。 人类染色体的原位杂交 DNA探针，通常为2-10 kb 的长度，探针带有标记作用的荧光基团。 同时检测多个位点，不要求建造特殊菌株。 固定过程和通透性可以干扰染色体原来的序列。 阻遏子-启动子的荧光系统 ( FROS) FROS是第一个在活细胞中直观具体地观察染色体行为的方法。利用了不同的荧光蛋白基因变异型（GFP、YFP、RFP）具有不同的发射光谱，把他们融合到LacI和TetR等不同的抑制子中，在细胞中，这些融合蛋白表达，并与lacO和tetO等特异性位点结合从而插入并结合到染色体中。 可以用荧光显微镜观察，使得染色体可视化。 但是，这种方法要求利用转座子在染色体中建造一系列随机结合位点（ lacO和tetO ） 需要防止这种抑制作用过度。 FROS允许快速摄像和微速摄影，同时可以跟踪两个或三种颜色（激光共聚焦）。 (Wang, X. et al.,2006,Genes Dev ) 利用阻遏子-启动子的荧光系统 ( FROS)来观察大肠杆菌的染色体复制的情况。 ParB–parS 系统 ParB–parS 系统也是利用荧光融合蛋白（ParB）和特异性识别位点（parS）特异性结合的方法，在细胞中，使染色体轨迹可视化。 EGFP YFP RFP ParB 环状DNA的拓扑学知识 共价闭合的DNA，不足以形成稳定的负超螺旋结构，但是在不同条件下，它可以存在于两个可以互换的形式——绞状螺旋线的环形结构和超螺旋的环形结构。 在体外，在生理缓冲液中，绞状螺旋线的螺旋结构通过右手旋线的环形结构构象。 环状的DNA能通过某些蛋白，形成稳定的左手螺旋环超环面负超螺旋结构的，这种结构具有更高水平的折叠和压实。 具体结构稍后再讲 大肠杆菌的染色体复制概述 L:把环状DNA“人为平铺打开”后从Ori的左边进行复制的复制轨迹； R:把环状DNA“人为平铺打开”后从Ori的右边进行复制的复制轨迹； ter：L和R复制叉最后“碰面”的在一定区域，复制终止区域。 L/R的颜色的强弱表示时间梯度 ——颜色越强，越靠后，越下游。 大肠杆菌的复制“对称”，ori，ter位于菌体“中间”，其他的菌种是不是也是这样的？？ = 柄杆菌属 具有 ori-proximal pole ter-proximal pole而大肠杆菌的ori和ter在菌体“中间”位置 弧菌属 有两个独立环形染色体，独立控制两个Ori 复制过程和大肠杆菌基本相同。但是，染色体复制后，被整编和拉长，两个染色体的Ori被一些列的蛋白固定在细胞两极， 如：DivIVA, RacA, soj 和 Spo0J。 SpoIII 把一个细胞极的挤进到前芽孢中。 为不对称分裂。 枯草芽孢杆菌 其他菌种的复制简介 E.coli 复制体 大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与。 整个DN