人参皂苷合成相关βAS基因的克隆及其反义植物表达载体的建立术.pdfVIP

中国生物工程杂志 China Biotechnology，2008，28(4)：74～77 人参皂苷合成相关13 AS基因的克隆 及其反义植物表达载体的建立术 赵寿经 侯春喜 梁彦龙 薛 健 王建华 (吉林大学生物与农业工程学院 长春 130022) 摘要 以发根农杆菌A4菌株诱导的人参发根为材料，用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA，得到 了纯度好的完整的总RNA。利用RT．PCR扩增了B香树素合成酶基因，测序结果表明该目的片 段与C,enBank上的B香树素合成酶基因序列一致。这一基因重组入克隆载体pMD．119T，并转化 大肠杆茵。在此基础上，利用pBI121质粒载体，构建了人参B香树素合成酶基因的反义植物表达 栽体，为这一基因的反义调控研究打下基础。 关键词 人参 B香树素合成酶 反义植物表达载体 中图分类号 Q786 人参是珍贵的药用植物，由于具有显著的药理活 根… ，本室保存。 性而得到十分广泛的应用 1“ 。人参的主要有效成分 菌株和质粒：大肠杆菌 DH5ct，根癌农杆菌 为人参皂苷，至今已从人参中分离出至少60种单体皂 LBA4404，pBI 121植物双元表达载体均为本室保存。 苷，除Ro外，均为达玛烷型三帖皂苷 。由于受资源 试剂：高保真 RT-PCR试剂盒，DNA扩增试剂盒， 限制，从人参植物中获得人参皂苷的成本越来越高。 DNA A-Tailing试剂盒，DNA胶回收试剂盒，DNA连接 通过改善人参皂苷生物合成效率，用遗传改良方法提 试剂盒均购自大连宝生物公司，异硫氰酸胍、青霉素、 高人参皂苷含量，是一项有意义的探索 。近年来发 卡那霉素购自北京鼎国生物公司，其余为国产分析纯。 展起来的反义RNA技术为调控生物合成途径关键酶 1．2 方 法 基因活性，改变特定产物的代谢流，提供了有效的手 1．2．1 人参发根总RNA提取 在常规方法 上作如 段 ”。 下改进：(1)减少样品的起始量，使之与提取缓冲液的 目前，人参皂苷生物合成途径已基本明确 。达 比例在 1：15左右；(2)13巯基乙醇浓度提高到 玛烷合成酶和p香树素合成酶(pAS)是分别催化达玛 0．3mol／L；(3)_20℃异丙醇沉淀RNA时加入与异丙 烷型三萜皂苷和齐墩果烷型三萜皂苷合成的两个关键 醇等体积的3mol／L NaAc。总RNA用1％琼脂糖凝胶 酶 Im】，我们试图通过建立p香树素合成酶基因的反 电泳检测。 义表达载体，利用反义RNA技术抑制p香树素合成酶 1．2．2 引物设计与合成 根据GenBank上8香树素 基因的表达，使代谢流主要流向达玛烷型三萜皂苷支 合成酶编码区设计引物，由宝生物公司合成： 路，从而达到增加人参皂苷含量的目的。 Ps：5 CCCGGGGAATGTGGAAGCTFAAGATAG 3 PA：5 TCTAG^1Tr^GGTGCCTAGGGACGGTAAT 3 1 材料与方法 1．2．3 RT-PCR反应 RT反应参照试剂盒说明书进 1．1 材 料 行。PCR反应体系20 ，包括：4pA cDNA，1×PCR 植物材料：MS固体培养基培养3周的人参发 Buffer；0．2pxnoVL引物，30 retool／L dNTPs，1U Taq HS DNA聚合酶。PCR循环条件为：94℃预变性4min， 收稿日期．2