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第三章 细胞生物学研究方法 一、细胞形态结构观察 （一）光学显微镜： 1、普通光镜的性能指标：放大率（放大倍数）分辨力、清晰度、焦点深度、镜象亮度。 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力，通常是以分辨距离来表示的，即分辨距离越小则分辨力越高。 人肉眼分辨力测试是规定在明视距离25cm所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼分辨力的极限值是0.1mm(毫米)，显微镜的分辨力可按下列公式来计算 R=0.61λ/N.A （R 是分辨距离，0.61是常数， λ是照明光波波长，N·A是显微镜物镜的镜口率——光学性能指标，每个物镜上都标有其镜口率的数值）。 ∵分辨距离R与镜口率N·A 成反比， ∴若把最大镜口率1.25（即油镜镜口率）代入公式，可以最小分辨距离≌/2由于可见光中最短波长（紫光）为0.4um（即400nm）。 ∴普通光镜最大分辨力的理论极限为0.2um ,请记住0.2um，这个数值就是显微镜水平与亚（超）微水平的分界线。 ∵显微镜的分辨力是有一定的极限， ∴其放大率受分辨力制约而不可能无限提高，普通光镜放大率的经验界值：有效放大倍数极限=物镜镜口率×1000。 例普通显微镜的油镜镜口率为1.25,故此台显微镜的最大有效放大倍数为1250倍。 高级研究显微镜油镜镜口率为1.4，则此镜的最大有效放大倍数为1400倍。 如果放大倍数超过限度，则视野中物象变模糊，细微结构反倒分辨不清，成为了无效放大，由于物镜镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制，不可能更大提高，所以科学家们从两个途径来改进显微镜： ⅰ、换用短波长的照明光源提高分辨力，如紫外光显微镜，电子显微镜； ⅱ应用特殊光学效应增强反差，提高分辨能力。 图2-1尼康E-600 显微镜 2、相差显微镜（phase contrast microscope） 用于没有染色的活细胞 原理：光波的三个光学特性（1）光波有波长，对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化（2）光波有振幅，对于光波振幅变化（即振幅差）肉眼觉察为明暗变化（3）光波有相位（相位是指某一时刻光在其前进路线上的位置）对于光相位的变化（即相位差），肉眼不能觉察。 图2-8 相差显微镜照明原理 当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（例如活细胞）其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现了一定程度变化，此时观察感觉反差小，物体内部结构难分辨，这就是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因，相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而反差增强，使能够清晰看到被检物体及其内部细微结构，所以相差显微镜下的样品不需染色，可清晰观察活细胞及其内部结构的变化。 特点：相差显微镜有正反差和负反差两种类型，正反差（暗反差）观察效果是被检物质比周围背景略暗，物体外围显现一圈亮的光晕，而负反差（明反差）的效果则是相反。 图2-9 一种介壳虫的染色体（PCM 照片） 3、荧光显微镜 （ fluorescence microscope） 原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析，荧光现象有两种： （1）自发荧光——细胞内某些天然荧光物质被紫外光照射所激发的荧光，例如叶绿素——血红色自发荧光。 （2）诱发荧光——在细胞中加入某种不会使细胞化学组分变性的荧光染料（荧光素），与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。 例：荧光染料吖啶橙，可使RNA 发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。 图2-2尼康E800 荧光DIC 显微镜 图2-3落射式照明原理 图2-4 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 特点：与普通光镜在结构上不同之处是： （1）采用紫外光发生装置，高压灯+激发装置+滤光装置。 （2）透镜由石英玻璃制成，以便减少道路上的紫外光损耗。 （3）目镜中装压紫滤片（保护眼睛）。 荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应用十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基因定位分析和对某些特异蛋白质进行定性定位检测分析，灵敏清晰，在荧光显微镜下对样品可同时采用两种以上（有的多达6~12种）荧光探针检测，依据其不同颜色的荧光信号，我们能一次判断识别多个基因位点，因此这是非常实用的研究技术，此外，由于在荧光标记检测实验中，易发生一些非检测目标出现假象的“背景