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WesternBlot实验实用技术手册汇编
Western Blot 实验技术手册
Western Blot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开,然后转移到固相载体(杂交膜)上,然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在,从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。目前Western Blot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一.
一、Western Blot基本操作流程图
细胞/组织蛋白提取
↓蛋白定量、蛋白变性
上样、 Western Blot操作步骤
1.蛋白提取、处理
蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏,因此,根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.
对于贴壁培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次,裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂吸净PBS,加入预冷的裂解液,用细胞刮子刮取贴壁细胞,将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中,4离心12,000 rpm,20 min(根椐细胞种类不同调整离心力)轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀.
用灭菌的预冷的工具分离目的组织,尽量置于冰上以防蛋白酶水解,将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中,加入液氮冻结组织于冰上均质研磨,长期可保存于-80°C,每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer,冰浴匀浆后置于4摇动2小时,裂解液体积与组织样本量有适当比例,(最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).4℃离心12,000 rpm,20 min,轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀BCA测定方法如下:
A. 酶标板操作
1.??????? 标准曲线的绘制:取一块酶标板,按照下表加入试剂
孔号 蛋白标准溶液(μL) 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水(μL) 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量(μg) 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 2根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀;
3各孔加入200μL BCA工作液;
4把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37放置30分钟,然后在562nm下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线;
5稀释待测样品至合适浓度,使样品稀释液总体积为20μL,加入BCA工作液200μL,充分混匀,37放置30分钟后,以标准曲线0号管做参比,在562nm波长下比色,记录吸光值;
6根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg),除以样品稀释液总体积(20μL),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位:μg/)。一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构(表位),因此,为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性,使之打开折叠的空间结构,蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer (loading buffer),并于95-100°C 煮沸 5分钟,对于多次跨膜蛋白,可以于70°C 加热 5-10分钟,标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer,上样时与样本混合后变性上样即可 X或6 X的上样缓冲液,如果上样buffer称为2X Laemmli buffer,上样时与样本:混合后变性上样即可 SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷,蛋白分子量不同,结合的SDS数量不同,所带负电荷也不同,电泳迁移速度不同,因此SDS电泳可将不同分子量的蛋白分离开。聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白,PAGE胶是由两种化合物聚合而成的,即丙烯酰胺(acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).,聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或 TEMED,凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量(%T))和交联度(%C),T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加,则孔径减小,5%C构成最小的孔径,任何的 %C增加或降低,孔径都增加,凝胶的百分浓度组成需两个参数,丙烯酰胺(acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度(w/v)。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度(参考下表》,原则上高分子量蛋白用低浓度胶,低分子量蛋白用高浓度胶分离。
蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度 (%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 阳性对照
目
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