WB实验步骤详细总结选读.docx

蛋白提取（所有操作在冰上进行）裂解配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）取2ml裂解液，加20μlPMSF混匀称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min离心（在基础4楼416室）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min用移液枪将上层清液取出放入①②号管中变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：S500：10S5100．000：10时间（时：分钟）温度（℃）保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用WB实验步骤清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。配制分离胶准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）5.91ml超纯水4.95ml丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效3.75mlPh8.8Tris?HCL150μl10%SDS150μlAP（催化剂促凝作用）9μlTEMED混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min浓缩胶的配制（5%）4.13ml超纯水1ml丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效750μlPh6.8 Tris?HCL60μl10%SDS60μlAP（催化剂促凝作用）6μlTEMED搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min电泳（电泳液最多使用两次）安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）Mark4μl（Protern ladder）推荐9μ，实际4μ已经足够样品8μl7-10μl均可内参挑齐即可组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡转膜（转移液可用3-4次）剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色封闭配制5%脱脂奶粉：小烧杯中混匀加入皿中2.5g脱脂奶粉50mlTBST将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）一抗用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体抗体的量：2l（Psmad2l）免抗1:10005μl：5ml58（分子量）2l（Psmad2l）免抗1:50010μl：5ml58Jnk免抗1:10005μl：5ml双带内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥1:50001μl：5ml36膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。二抗用3%的脱脂奶粉小烧杯中混匀加入皿中1.5g的脱脂奶粉50mlTBST每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1μl注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则