凝胶迁移或电泳迁移率实验emsa技术 - 基莱生物.doc

什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)？ 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。EMSA原理示意图如下： ? 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)常用的实验手段有同位素32P法和非同位素法（化学发光法）。 一般做这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影， 或用PhosphorImage分析。? 成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白， 是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20uL）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 0.5mM DTT, 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.05mg/mL poly(dI:dC)?dI:dC,或10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 10%甘油，0.05mg/mL poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。? 常用的同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类dsDNA探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。转录调控因子探针 探针名 / 目录号 / 序列（上链） / 序列的出处Sp1 / E3231 E3232 / 5`-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3` / SV40启动子（1）AP1 / E3201 E3202 / 5`-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3` / 胶原酶基因TRE（2）AP2 / E3211 E3212 / 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3` / 人金属硫堇II a（3）基因NF-kB / E3291 E3292 / 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3` / 鼠Igk轻链基因（4）Oct1 / E3241 E3242 / 5`-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3` / Ig重链基因（5）CREB / E3281 E3282 / 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3` / 大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID / E3221 E3222 / 5`-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3` / belta-1球蛋白启动子注：只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。粗体字表明序列来源于指定的基因序列，转录