2015年分子生物学实验.PPT

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNA Extraction Kit 试剂盒组成： Mini column: 50个 2ml Collection: 50个 Buffer KPL1 ：50ml （lysis solution） Buffer KB ：30ml (column balance solution) Buffer KW：(wash solution)使用前加50ml无水乙醇 Buffer KE： 10ml (elution) 操作步骤 (一) 平衡吸附柱 取一吸附柱装入2ml收集管中。 加入300ul Buffer KB至平衡柱，室温下12000rpm离心1min，废弃收集管中滤液，将平衡柱套回收集管备用 (二)样品处理 将10-100mg植物组织直接放入研钵，加入500ul的KPL1，研磨匀浆，然后转入1.5ml离心管，室温下12000rpm离心2min。 (三) 吸附 将上步离心上清液，移至平衡好的吸附柱中，室温下12000rpm离心30s，废弃收集管中过滤液，把平衡柱装回收集管。 (四) 漂洗 加入700ul Buffer KW，室温下12000rpm离心30s，废弃收集管中过滤液，把平衡柱装回收集管。 用700ul的70%乙醇洗涤平衡柱，12000rpm离心1min，废弃收集管中过滤液。 (四) 漂洗 将上步平衡柱套回收集管，室温下12000rpm离心2min，以甩干残液。 (五) 洗脱 把平衡柱装入新的1.5ml离心管，加入50ul的KE Buffer，65℃下放置5-10min，室温下12000rpm离心1min洗脱。 4℃下保存备用。 * * 【实验结果】 提取得到的DNA应为一条带，如DNA降解会出现弥散带。 【思考题】 1.在DNA提取时，SDS、NaCl、EDTA、氯仿/异戊醇及无水乙醇各起什么作用？ 2.如何制备1％的琼脂糖凝胶？ 【实验安排】 提前两星期准备幼苗，一个下午提DNA并检测。 * * * * * * * * * * * * * * 调中性，以利于细菌的生长繁殖 * * * * * * * * * * * * 仪器与试剂 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析系统 3、单面刀片 4、离心机 5、恒温水浴锅 6、DNA回收试剂盒 7、ddH2O * * 实验步骤（具体步骤以试剂盒为准） 1. 在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。 2. 按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。 3. 将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。 4. 在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 * * 实验步骤 5. 再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6. 12000rpm 室温空离心1分钟。 7. 将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 8. 琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。（可不做） * * 切胶示意图 * * 凝胶纯化结果示意图 注意事项： 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛； 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。 【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？ * * 实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 【实验目的】 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和将外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术及转化体筛选的技术方法。 【实验原理】 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（ 如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。 * * 【实验原理】 转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。 进