基因治疗研究八年制.pptVIP

第二十章 基因治疗研究 基因治疗 在基因水平上进行的治疗手段。针对患者的基因缺陷，导入特定基因补偿其缺陷或赋予机体新的功能以抗衡缺陷。 基因治疗最初是针对遗传病的根治而提出的。 肿瘤与病毒性基因的基因治疗，导入特定基因抵抗肿瘤生长或病毒侵袭。 基因治疗的基础：成熟的基因克隆技术以及基因的导入与表达技术。 基因治疗的发展史 最初的尝试： 1966 年，Rogers 发现兔乳头状瘤病毒 (RPV) 可诱导人体生产精氨酸酶。 1973 年，Shope 发现 RPV 能诱导精氨酸血症患者皮肤成纤维细胞生成精氨酸酶。 几名德国医生将 RPV 用于治疗幼儿的精氨酸血症。结果并不成功。 首例真正的基因治疗 1980 年，Cline 等将基因治疗手段运用于重型β地中海贫血。 自患者抽取骨髓细胞，在体外将 TK-β珠蛋白基因导入后静脉输回患者体内。 接受治疗的两名患者在治疗 3-10 内可检测到导入的基因序列。但限于导入方法(磷酸钙沉淀法)，未观察到明显的治疗效果。 Cline 的研究事先未得官方许可，因此遭受了广泛抨击。直到 1989 年，临床实验一直未能得到批准。 首例正式的人体实验 1980 年代，基因治疗的手段在动物实验中逐步成熟。 1989 年，NIH 正式批准了首例人体实验。 Neor 基因被转移到患者的肿瘤浸润性淋巴细胞内，以追踪其代谢情况。 研究证实了基因导入的无害性。 此项人体实验为其后的基因治疗奠定了基础。 首例成功的基因治疗 1990 年，NIH 进行了首例基因治疗的人体实验，并取得有限的成功。 4 岁的腺苷脱氨酶缺乏症患者接受了基因治疗。 取淋巴细胞进行体外培养，反转录病毒导入正常腺苷脱氨酶基因，注射回患者。 患者免疫功能明显提高。 基因治疗的现状 基因治疗是目前医学分子生物学的重要研究领域。 基因治疗从遗传缺陷的矫正扩展到恶性肿瘤、病毒性疾病、心血管疾病以及糖尿病等的治疗。 鉴于基因治疗的临床实验均效果不佳，自 95 年其人体实验逐步降温。研究主要集中于相关方法与技术的动物实验。 一、基因治疗的方法 基因治疗的前提是对疾病相关基因的克隆及其分子机理的阐明。 有效的基因转移 (或称基因导入) 手段是基因治疗的基础。 成功的基因治疗还需要高水平的基因表达与精细的基因调控。 基因治疗必须保证安全性。 1. 基因治疗的策略 基因置换：通过同源重组的方式，以正常基因置换缺陷基因。 基因替代：导入正常基因，矫正缺陷基因的功能。 基因干预：促进或抑制特定基因的表达。 开放γ珠蛋白基因治疗贫血。 抑制癌基因表达治疗恶性肿瘤。 基因增补：引入本来不表达基因。 引入 INF、TNF、IL 等基因，提高免疫力。 2. 基因导入的基本途径 Ex vivo 途径：体外转移后导入的途径。 取实验对象体细胞进行体外培养，在体外完成基因导入后将细胞注射回对象体内。 目前大多数研究采用的方法。 In vivo 途径：活体直接导入。 通过重组病毒载体，脂质体或裸露 DNA 直接注射到体内。 尚未成熟的方法，是基因治疗导入途径的最佳选择。 3. 基因导入的方法 物理方法：裸露 DNA 直接注射、电穿孔方法等。 化学方法：磷酸钙沉淀法、脂质体法等。 生物方法：主要是重组病毒介导的基因转移。 病毒介导的方法具有效率高，更易应用于活体转移，易获得稳定表达的细胞等优点。 可能存在一定的安全隐患。 基因导入的物理方法 裸露 DNA 直接注射：直接包含目的基因的质粒注射到肌肉等组织。 简便易行，但效率不高，很难获得稳定表达。 DNA 颗粒轰击：以金钨等金属颗粒吸附 DNA，在高压作用下导入细胞 (基因枪)。 可应用于活体或体外培养细胞。 电穿孔：脉冲电场提高膜通透性，细胞膜的微孔可转入外源 DNA。 广泛应用于体外培养细胞，转移效率约 10－3。 基因导入的化学方法 磷酸钙沉淀法：利用 DNA 与磷酸钙形成的共沉淀，协助 DNA进入细胞。 导入效率最高可达 20％，但稳定表达较低 (10－3)。 只能应用于离体培养细胞的基因转移。 脂质体法：以脂溶性物质包裹 DNA，协助其通过细胞膜。 导入效率可高达 100％，且简便易行。 目前主要应用于体外培养细胞。也可应用于活体直接导入。 生物方法：病毒介导的基因转移 反转录病毒载体：最广泛使用的载体，转移效率高，且能介导基因整合。 腺病毒载体：较为安全的载体，具有更广泛的宿主范围。 单纯疱疹病毒载体：可感染非分裂细胞，如神经细胞。 腺相关病毒载体：具有安全性且能介导整合的双重优点。 反转录病毒转移系统 常规的反转录病毒主要构建自小鼠 Mo-MLV (Moloney murine leukemia virus) 。 特点： 高效率，可达 10－100％。 稳定性，可介导整合，不发生丢失。 选择性，只感染分裂细胞。 Lent