免疫胶体金银技术.ppt

免疫金技术发展简史 1971年 胶体金应用于免疫组化 1978年免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原 1981年免疫金银法 1986年彩色免疫金银法 3 蛋白质的胶体金标记 原理： PH值等于或稍偏碱性的蛋白质等电点时，蛋白质呈中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质表面张力最大，处于微弱的水化状态，能牢固吸附于金颗粒表面，形成蛋白层，阻止胶体金颗粒相互接触，而使胶体金处于稳定状态； PH值高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒负电荷相互排斥不能结合。 稳定剂：牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明胶 （1）待标记蛋白质准备 透析除盐 除去蛋白质内多余电解质，过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的电位，影 响蛋白质吸附。 方法:蛋白质置于透析袋直接放入双蒸水或极低浓度盐水透析 去除蛋白沉淀 低温保存的蛋白质或抗体易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针 的稳定性有影响，标记前离心除去聚合物。 待标记蛋白质最适稳定量的测定 光电比色法、目测法 5nm SPA胶体金电镜观察 * * 第六章 免疫金银及铁标记技术 免疫胶体金银技术 一、免疫金技术 二、免疫金银法 三、彩色免疫金银法 四、免疫金和免疫金银法的优点 五、免疫金银法染色中常见的问题及对策 六、免疫胶体铁技术 一、免疫金技术 胶体金：金的水溶液，具有一般溶胶特性。 胶体金制备：化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。 胶体金颜色：用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。 5-20nm 葡萄酒红 20-40nm 深红色 60nm 橙黄色 还原剂：白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。 (2)试剂 容器: 酸处理洗净 配制试剂: 双蒸馏水或三蒸馏水 氯化金水溶液的配制：1g的氯化金溶解于双蒸水中配成l％的水溶液；4℃冰箱内保存。 白磷配制：在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存 不需硅化处理可直接制备胶体金。 为了减少了金颗粒的吸附作用，也可用已制备的同等大小颗粒的胶体金溶液包被玻璃器皿表面，弃去，再用双蒸水洗净。 流水冲洗；清洁液浸泡24h；自来水洗净清洁液；洗洁剂洗3～4次；自来水冲洗；蒸馏水洗3～4次；双蒸水把每个器皿洗3～4次；烤箱干燥后备用。 1 制备胶体金的准备 （1）玻璃器皿的清洁 2 胶体金的制备 白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、柠檬酸钠—鞣酸还原法、乙醇超声波还原法、硼氢化钠还原法、放射性胶体金制备法 常用的方法:2种 (1)柠檬酸三钠还原法 制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。 制备胶体金时金颗粒的大小与柠檬酸三钠用量成反比。 操作步骤： 1）1ml l％氯化金加入100ml蒸馏水中，煮沸。 2）迅速加入4mll％柠檬酸钠，保持沸腾状态，搅动至出现透明的橙红色。 3）自来水冲洗烧瓶，冷却。 (2)柠檬酸钠—鞣酸还原法 特点：通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金， 且颗粒的直径均匀一致，适合于双标及多标研究。 操作步骤： 1）根据所需的胶体金颗粒分别配制A液和B液。 2）将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃，保持温度稳定。 3）在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液，加热7～10min至胶体 金变成葡萄酒色。 4) 用自来水冲洗烧瓶，使之迅速冷却。 原理：柠檬酸三钠—— 主要为还原剂。 鞣酸—— 还原、保护作用，决定胶体金颗粒大小形成。 制备胶体金时都应注意以下各点： ① 所有溶液均应用双蒸水配制 ② 柠檬酸钠与鞣酸溶液应现用现配 ③ 用于制备胶体金的烧瓶硅化需处理 ④ 在清洁干燥的烧瓶中加入少许1％硅油，轻轻转动烧瓶， 使硅油均匀铺展于烧瓶内壁，倾出多余硅油。 烧瓶置烤箱内烘干。 上述步骤可重复2～3次 （2）胶体金PH值调整 标记前将胶体金溶液的PH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱 （3）蛋白质的胶体金标记 （1）根据标记胶体金的总量计算所需待标记蛋白质的总量。 （2）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH），逐滴加入蛋白质，1mg的蛋白质大约5min