正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞DNA损伤的实验研究论文.docVIP

　　正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞DNA损伤的实验研究论文 齐宝宁，易建华，唐国慧，苗江丽，郭剑锋 【摘要】 目的 研究正己烷(nhexane)对大鼠的脂质过氧化作用和肝细胞DNA损伤的影响。方法 40只雄性SD大鼠随机分成5组，即阴性对照组、75、150、300mg/kg染毒组和阳性对照组，每组8只。经腹腔注射染毒4周后，检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的活力.freelelting agarose gel, LMA)、正常熔点琼脂糖(normal melting agarose gel, NMA)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2ethylenediamine, Na2EDTA)、溴化乙锭(ethidium bromide, EB)均为美国Sigma公司产品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)测试盒均为南京建成生物工程研究所产品。 1.1.3 仪器 DYYⅢ水平电泳槽 ，DYY Ⅲ33A电泳仪 ，NIKON荧光显微镜型及NIKON AFXⅡA型拍摄装置 ，恒温水浴箱，DY89Ⅱ型电动玻璃组织匀浆器，CASP图像分析软件。 1.2 方法 1.2.1 动物分组及染毒 将40只雄性SD大鼠随机分为5组，即阴性对照组、低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组和阳性对照组(环磷酰胺)，每组8只，采用腹腔注射染毒5。阴性对照组仅用注射针穿刺腹腔，不注射任何试剂，低、中、高暴露组染毒剂量分别为75、150、300mg/kg，阳性对照组为50mg/kg，每日上午染毒1次，每周5d，连续4周。染毒过程中，所有大鼠均自由饮水、进食。每3d称体重1次，调整染毒剂量，记录大鼠的一般状况和体重变化。 1.2.2 单细胞凝胶电泳试验 参照Singh等7方法略加改进。主要步骤有：①单细胞悬液的制备。染毒结束后，用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，剖开腹部，立即取出一5nm×5nm肝脏组织，装于盛有4℃磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)的小烧杯中，洗去血液，然后加入RPMI 1640培养液，用眼科剪剪碎，制成单细胞悬液。② 胶板的制备。将预热50℃ 100μL质量分数为0.6%的NMA滴加到无水乙醇浸泡的磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，室温下静置10min使其凝固，为第1层凝胶；取10μL大鼠肝细胞悬液加入37℃ 80μL质量分数为0.5%的LMA中，混匀后迅速滴加到第1层胶上，立即盖上干净的载玻片，室温下静置10min使其凝固，为第2层胶；最后在第2层胶上滴加预热37℃的质量分数为0.5%的LMA,盖上盖玻片，室温下使其凝固。③细胞裂解。移去盖玻片，将载玻片浸入新配制的细胞裂解液(2.5mol/L NaCl，100nmol/L Na2EDTA，10nmol/L Tris，10g/L肌氨酸钠，临用前加体积分数为1%的TritonX100，10% DMSO，pH＝10)中，于4℃冰箱中裂解1h。④碱解旋。从裂解液中取出载玻片，用PBS冲洗2次，洗去过多的盐，晾干后置于水平电泳槽中，将新配制的电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH=13，4℃预冷)倒入电泳槽中，液面约覆过胶面0.25cm左右，避光静置25min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋成单链DNA，使DNA断片在电泳场中易于迁移。⑤电泳。电压为25V，电流300mA，4℃环境下电泳20min。⑥中和与染色。电泳结束后，取出载玻片，吸水纸吸干电泳缓冲液，用0.4mol/L的TrisHCl(pH＝7.5)中和15min，然后每片载玻片上滴加30mg/L的EB水溶液50μL，盖上盖玻片，染色20min，即可观察。⑦阅片。24h内在荧光显微镜下观察，数码相机拍摄照片，每张玻片随机拍摄30个细胞，在电脑上用CASP彗星软件分析。 1.2.3 血清脂质过氧化指标的测定 染毒结束后，用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部开U型口，暴露心脏，从心尖抽取5mL全血，置于试管中，37℃水浴2h，离心(3000r/min，10min)，分离血清检测GSH和MDA含量。MDA含量测定按硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,.freelan微量法。 1.2.4 组织匀浆抗氧化酶活力测定 立即取新鲜肝脏