第四章外植体的选择和灭菌.ppt

主要内容及其要求： 1. 理解外植体的选择方法 2. 掌握外植体的表面灭菌方法 3. 掌握培养物的污染原因和预防措施 作业题 1、简述植物各种组织的表面消毒方法。 2、如何防止外植体的细菌污染和真菌污 染？ * * 第四章 外植体的选择和灭菌 ? 外植体的选择 ※植物体的各个部位(从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等各个部分。) ※生长开始的季节采样：较幼嫩的材料 ※器官的生理状态和发肓年龄 ※外植体的大小为0.5－1.0cm ?? 外植体的灭菌方法  常用的灭菌剂有漂白粉（1%~10%的滤液），次氯酸钠溶液（0.5%~10%），氯化汞（0.1%~1%），酒精（70%~75%），过氧化氢（3%~10%），新洁尔灭等。 灭菌程序： 第一步是刷洗，冲洗材料 第二步是洗后的材料用滤纸吸干水分，浸泡于灭菌药剂。 自来水较长时间冲洗+70%酒精浸泡植物种+无菌水冲洗2~3次+2%~10%NaClO（0.1%HgCl2）12min+无菌水冲洗3次。 茎尖、茎段及叶片等材料的灭菌 果实及种子的灭菌 自来水冲洗10~20min + 70%酒精迅速漂洗一下（或用2%NaClO溶液浸泡10min ）+无菌水冲洗2~3次 自来水冲洗10~20min+10%Ca（ClO）2浸泡20~30min+70%酒精+2%NaClO溶液浸泡10min+无菌水2~3次 种子则先要用10%Ca（ClO）2溶液浸泡20~30min甚至几小时，依种皮硬度而定。 花药的灭菌 70%酒精浸泡数秒钟+无菌水冲洗2~3次+漂白粉溶液中浸泡10min+无菌水冲洗2~3次 根及地下器官的灭菌 自来水洗涤+纯酒精漂洗+0.1%~0.2HgCl2 浸泡5~10min(或2%NaClO浸泡10~15min) +无菌水冲洗3次 ? 污染原因和预防措施 污染的病原分为细菌和真菌两大类。培养基的污染可能的来源有培养容器、培养基本身、外植体、接种室的环境、再接种和继代时用以转接植物材料的器械、培养室的环境以及操作者本人。 细菌污染1、? 现象在培养中，在培养材料附近出现黏液状物体或混浊的水迹状痕或出现泡沫的发酵状情况，或在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹，这大多是细菌污染到造成的现象。细菌污染的特点是菌斑呈黏液状物，一般在接种1~2天即可发现。2、? 原因材料带进菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员的不慎等都是造成细菌污染的重要原因。3、? 防治方法为了减少或消除由操作人员带来的污染，接种前，工作人员必须很好地洗手，还要用70%酒精擦拭双手。接种用的镊子或解剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌。材料接种好以后，将瓶口置于火焰上转动，使瓶上各部分都烧到，目的是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。 真菌污染1、现象真菌污染就是培养基上长霉，一般接种后3~5天就可发现霉的颜色有黑、白、黄等。2、原因 一般多以周围环境不清洁和空气污染造成。如：接种室的空气本身不洁净，灰尘较多；超净工作台的过滤装置失效；培养用器皿的口径过大，操作不慎等原因引起。3、?防治措施在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种前，应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰的前方等等。