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真菌检测步骤
真菌检查步骤1.采集标本浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等,标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织,采集标本时应注意无菌操作。2.检查方法真菌检查的方法主要有:(1)直接涂片:为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上,加一滴10%KOH溶液,盖上盖玻片,在酒精灯火焰上稍加热,待标本溶解,轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或孢子,但不能确定菌种。(2)墨汁涂片:用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本(如脑脊液)混合,盖上盖玻片后直接镜检。(3)涂片或组织切片染色:涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等;瑞氏染色适用于组织胞浆菌;组织切片通常用PAS染色,多数真菌可被染成红色。(4)培养检查:可提高真菌检出率,并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上,置室温或37℃培养1~3周,必要时可行玻片小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断,对某些真菌,有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。四、真菌学检验的基本技术(一)?? 直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法,常用的方法有:①氢氧化钾/复方氢氧化钾法:标本置于载玻片上,加一滴浮载液,盖上盖玻片,放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2~3次,不应使其沸腾,以免结晶,然后轻压盖玻片,驱逐气泡并将标本压薄,用棉拭或吸水纸吸去周围溢液,置于显微镜下检查。检查时应遮去强光,先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子,然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液:A.10%~20%的KOH。配方:氢氧化钾10~20g,蒸馏水加至100ml,待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内,适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。B.复方氢氧化钾溶液配方:氢氧化钾(AR)10g,二甲基亚砜(AR)40ml,甘油50ml,?蒸馏水加至100ml,配制方法:将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后,再依次加入DMSO、甘油揺匀后,用蒸馏水加到100ml,装入塑料瓶内。此配方的优点是:配方中加DMSO,能促进角质的溶解,有甘油涂片不易干,不易制成氢氧化钾结晶,氢氧化钾的浓度相对低,腐蚀性亦低,为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。②胶纸粘贴法:用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下,撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上,使原贴在取材部位的一面暴露在上面,再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色,在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反,而且要充分展平,否则影响观察。③涂片染色检查法:在载玻片上滴1滴生理盐水,将所采集的标本均匀涂在载玻片上,自然干燥后,火焰固定或甲醇固定。再选择适当的染色方法,染色后,以高倍镜或油镜观察。常见镜检染色方法有:①革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性,被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。②乳酸酚棉蓝染色:用于各种真菌培养物的镜检。③印度墨汁:用于检测脑脊液(CSF)中的新生隐球菌。④抗酸染色:用于抗酸菌及诺卡菌的诊断。⑤瑞氏染色:用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。⑥过碘酸锡夫染色(PAS):用于体液渗出液和组织匀浆等。真菌胞壁中的多糖染色后呈红色,细菌和中性细胞偶可呈假阳性,但与真菌结构不同,不难区别。⑦嗜银染色(GMS):真菌可染成黑色,主要用于测定组织内真菌。(二)?? 真菌培养从临床标本中对致病真菌进行培养,目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率,以弥补直接镜检的不足,同时确定致病菌的种类。真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外,还应准备真菌专用的接种针、接种环、或接种钩(用铂丝或镍丝制成)、微型小铲、刀片、针头等,常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养基,加0.05%氯霉素,还有多种性质的培养基(见第二部分)以满足各种不同的需要,可酌情选用接种的方法,根据不同的临床标本,大体可分为点植法和划线法两种。①点植法:适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本,将标本直接与培养基表面点状接触。②划线法:适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本,用接种针(环)划线接种在培养基表面。培养方法有多种,接临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法;按培养方法分为试管法、平皿法(大培养)和玻片法(小培养)。①直接培养:采集标本后直接接种于培养基上。②间接培养:采集标本后,暂保存,以后集中接种。③试管培养:是临床上最常用的培养方法之一,培养基置于试管中,主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存。④大培养:
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