黄曲霉毒素降解酶在酿酒酵母细胞表面上的展示及酶活性质的研究.pdf

摘要 黄曲霉毒素(Aflatoxin ，AFT)为黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，是一类能够致癌， 致畸，致突变的真菌毒素，被世界卫生组织列为一级致癌物，传统的物理、化学的去毒方 法会造成营养成分大量损失，因此，近些年来，高效稳定的生物学方法备受科研者的关注。 本研究从假蜜环菌（Armillariella tabescens ）的总RNA 出发，克隆编码得到黄曲霉毒素 降解酶（Aflatoxin-detoxifizyme ，ADTZ ）基因，并把该基因连接到表面展示质粒载体pYD1 上，成功构建了重组质粒pYD1-ADTZ ，并将其转化到酿酒酵母菌EBY100 中，通过PCR及 双酶切筛选出阳性转化子，证明了ADTZ基因已经整合到酿酒酵母基因组中，经诱导表达 后，用高相液相色谱法定性检测，结果表明：当诱导时间为96h ，反应温度为28℃，反应 时间为30min 时，表面展示的黄曲霉毒素降解酶对黄曲霉毒素的去毒率为12.26%，再通过 ELISA法定量检测黄曲霉毒素降解酶对黄曲霉毒素B 的降解情况，经过测定，相同条件下， 1 表面展示的黄曲霉毒素降解酶对黄曲霉毒素的去毒率达到13.1%，酶活力达到0.93U/L 。 通过对表面展示的黄曲霉毒素降解酶的酶活性质的初步研究，分别诱导12h，24h ，48h ， 96h ，发现当诱导时间为48h 时，黄曲霉毒素降解酶对AFB 的去毒率达到最大值，此时去毒 1 率为24.2% ，表面展示ADTZ与黄曲霉毒素B 的最佳反应时间为3h 时，酶活性达最大，最大 1 去毒率为27.3% 。总结不同反应时间，不同诱导时间对去毒率及酶活性质的影响，为下一 步工作——将黄曲霉毒素降解酶制备成饲料添加剂做准备。 关键词：黄曲霉毒素；黄曲霉毒素降解酶；酵母细胞表面展示系统；酶联免 疫；去毒率 I Abstract Aflatoxin (AFT), the secondary metabolites of aspergillus flavus and aspergillus parasiticus, belongs to a category of mycotoxins which causes carcinogenic, teratogenic and mutagenic effects, and it is also ranked by WHO as the Group I carcin ogens. The traditional physical and chemical detoxification methods of aflatoxin are both unstable and can lead to significant loses of nutrition, biological methods which are highly efficient and relatively stable attracted much attention from scientific researchers in recent years. In this pater, the gene encoding of ADTZ is cloned from the total RNA of armillariella tabescens, and the genes are connected to the pYD1 vector of the surface displaying plasmid. Then, pYD1-ADTZ, the recombinant